前言 1型糖尿病是一种受多基因调控,以胰岛素缺乏及高血糖为主要特征的自身免疫性疾病。目前的治疗手段主要是外源性胰岛素替代治疗,但每日注射胰岛素除给患者带来痛苦和不便外,还可导致严重低血糖。近年来,分子生物学尤其是重组DNA技术不断发展,由于糖尿病是因单一组分胰岛素缺乏引起的,且糖尿病患病率较高,使之成为基因治疗研究的热点之一。 本实验在前人将furin酶识别序列引入人胰岛素原基因并在其上游连接两个调控元件的基础上,采用定点突变技术,将人胰岛素原基因B链10位组氨酸突变为天冬氨酸,以增加成熟胰岛素的稳定性和产量。随之将携有调控元件的突变胰岛素原基因导入逆转录病毒载体,构建逆转录病毒重组质粒,并采用脂质体转染法将重组质粒导入PA317包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出一株高效特异的产病毒细胞克隆,为下一步的细胞和动物实验打下基础,从而为糖尿病基因治疗最终应用于临床做基础性的铺垫。 实验材料与方法 一、诱导人胰岛素原基因B链10位组氨酸突变为天冬氨酸 1.设计引物。 2.PCR反应并应用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段。 3.DNA片段的末端平滑,5’磷酸化,行连接反应。 4.PUC118-GⅡ₃导入感受态细胞,菌落的鉴定。 5.PUC118-GⅡ₃质粒的提取,纯化。 6.PUC118-GⅡ₃测序,以证实点突变的存在。 二、逆转录病毒重组质粒的构建