斯替夫苷转苷衍生物的酶法制备及其性能的研究

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斯替夫苷是一种天然低热值的非营养型高倍甜味剂,但其后苦涩味限制了其应用。本文主要研究了环糊精葡萄糖基转移酶和共价交联法固定化环糊精葡萄糖基转移酶催化其进行转苷反应以去除后苦涩味;应用微波辐射辅助环糊精葡萄糖基转移酶催化斯替夫苷进行反应并初步探索了化学法合成斯替夫苷转苷衍生物;最后对于转苷产物进行了性能测定。主要研究内容如下:1首先考察了糖基供体对环糊精葡萄糖基转移酶催化斯替夫苷转苷反应的影响,发现以β-环糊精为供糖体时斯替夫苷的转化率最高,并且转化率随着反应时间的延长逐渐提高,8h后反应达到平衡。单因素实验得到合成斯替夫苷葡萄糖基衍生物的条件如下:以水为溶剂,反应温度60oC,β-环糊精与斯替夫苷的摩尔比1.06:1,5%的底物质量浓度,10U/g斯替夫苷的加酶量,200r/min恒温培养振荡器中反应5h,斯替夫苷的转化率最高可达到87.8%。以性价比较高的玉米淀粉水解液为糖基供体时,在最佳工艺条件下斯替夫苷的转化率为59.9%。2以壳聚糖为固定化载体,戊二醛为交联剂共价交联法固定环糊精葡萄糖基转移酶。单因素考察确定了壳聚糖微球固定CGTase的最佳条件:25oC,2%的壳聚糖乙酸溶液(乙酸溶液的体积分数为2%),V(10%NaOH):V(95%C2H5OH)=1:1,0.2g壳聚糖微球,25%的戊二醛0.8mL配成5mL缓冲液体系,交联1h,加酶10U,吸附15h,酶活回收率达到94.5%。应用固定化的CGTase催化斯替夫苷进行转糖基反应时,与游离酶相比,固定化酶的最适催化温度提高5oC,最适催化pH不变,在非最适pH时斯替夫苷的转化率提高5%-8%,5h时热稳定性增强10%。固定化酶重复使用7次后酶活仍保持原来的40%左右。3通过引进微波辅助酶催化和化学法合成斯替夫苷葡萄糖基衍生物。对转苷反应进行了单因素考察,确定了50W,55oC纯水体系中,底物质量比为1.5:1,加酶10U/g斯替夫苷,反应1min为最佳催化条件,此时斯替夫苷的转化率达50.5%。与常规加热法相比,微波辅助酶催化加快了反应速度。在化学法合成斯替夫苷转苷衍生物的实验中,初步研究了糖基供体、Lewis酸种类、有机溶剂对转苷反应的影响。发现只有以葡萄糖为糖基供体时才会发生转苷反应,AlCl3的催化效果最佳,无水乙醇溶液中斯替夫苷的转化率比水溶液中高20%。研究了Lewis酸,有机溶剂对环糊精葡萄糖基转移酶催化斯替夫苷转苷反应的影响。与纯酶催化反应相比,AlCl3抑制环糊精葡萄糖基转移酶的活力导致斯替夫苷的转化率为0,而硼酸则有助于提高斯替夫苷的转化率,加入乙醇、乙酸乙酯和石油醚有机溶剂时,斯替夫苷的转化率均降低。4本文初步研究了原料斯替夫苷(St90),Thermoanaerobacter Toruzyme3.0L环糊精葡萄糖基转移酶,Bacallus macerans环糊精葡萄糖基转移酶和Paneibacillus maceransJFB05-01环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉水解液和斯替夫苷进行转糖基反应得到转苷产物的性能。主要研究了其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟基自由基的清除活性,抗脂质过氧化活性和抑制酪氨酸活性,结果发现斯替夫苷和转苷产物均有较好的生物活性,其中Paenibacillus macerans JFB05-01环糊精葡萄糖基转移酶催化斯替夫苷进行转糖基反应得到的转苷产物活性最佳。
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