【摘 要】
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马氏珠母贝作为一种重要的海水育珠贝类,探究其贝壳生长的分子机制具有重要意义。课题组前期通过GWAS分析关联到一个Lnc RNA033033与马氏珠母贝贝壳生长性状显著相关。因此,本研究对Lnc RNA033033进行鉴定和功能研究,并探究其通过介导章鱼胺信号分子调控马氏珠母贝生长的作用机制。主要研究结果如下:1.LncRNA033033的鉴定和功能研究通过克隆获得LncRNA033033,序列全长
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马氏珠母贝作为一种重要的海水育珠贝类,探究其贝壳生长的分子机制具有重要意义。课题组前期通过GWAS分析关联到一个Lnc RNA033033与马氏珠母贝贝壳生长性状显著相关。因此,本研究对Lnc RNA033033进行鉴定和功能研究,并探究其通过介导章鱼胺信号分子调控马氏珠母贝生长的作用机制。主要研究结果如下:1.LncRNA033033的鉴定和功能研究通过克隆获得LncRNA033033,序列全长共568 bp,最大ORF为138 bp,编码的可能性大约为0.0096,未发现任何编码标记,提示Lnc RNA033033不具有编码蛋白的潜能。在Lnc RNA033033基因中筛选得到17个突变位点,进行连锁不平衡分析后得到3个单倍型blocks,而关联分析结果表明这3个单倍型blocks都与马氏珠母贝的生长性状显著相关（P＜0.05）。利用q RT-PCR技术检测Lnc RNA033033在马氏珠母贝各组织的基因表达情况表明,在外套膜膜中央膜区（MC）的表达水平最高（P＜0.05）,套膜区、边缘区（ME）次之。通过检测马氏珠母贝早期胚胎发育,发现Lnc RNA033033均有表达。另外,在成贝贝壳损伤后12 h开始Lnc RNA033033的表达水平逐渐上升,在48 h时Lnc RNA033033的表达量最高（P＜0.05）。通过RNA干扰实验对Lnc RNA033033敲降后,结果显示敲降后的贝壳珍珠层和棱柱层的形成都出现了明显的紊乱。RNA pulldown实验检测发现Lnc RNA033033与章鱼胺受体蛋白存在互作关系故推测Lnc RNA033033可能与章鱼胺受体蛋白互作,通过调控贝壳的矿化影响马氏珠母贝的生长。2.章鱼胺与LncRNA033033对章鱼胺信号传导的研究用不同浓度的章鱼胺（OA）处理HEK 293T细胞后,随着OA浓度上升,c AMP水平也随之上升,当OA浓度为10-5M时,c AMP浓度达到最高,说明OA可以作为信号分子调控c AMP浓度而影响代谢。对比转染OAR实验组、Lnc RNA033033实验组、OAR+Lnc RNA033033实验组以及对照组在OA刺激情况下的荧光素酶活性,发现OAR组显著高于对照组和Lnc RNA033033实验组（P＜0.05）;而OAR+Lnc RNA033033实验组的荧光素酶活性低于OAR实验组,但未达到显著差异,说明Lnc RNA033033对OAR有一定的抑制作用。当没有OA刺激时,OAR组、Lnc RNA033033实验组、OAR+Lnc RNA033033组和对照组之间的荧光素酶活性没有显著差异（P＞0.05）。这些结果说明章鱼胺（OA）可以通过章鱼胺受体（OAR）激活c AMP信号传导通路,Lnc RNA033033可能通过抑制章鱼胺受体的活性发挥调控作用。3.章鱼胺对马氏珠母贝生长和代谢的影响研究通过不同浓度的章鱼胺（OA）浸泡处理马氏珠母贝后,各组间存活率无显著差异。而贝壳生长的绝对增长率在组间有显著差异:对照组壳高和壳长的绝对增长率显著高于各实验组（P＜0.05）,而绝对增长率随OA浓度的升高逐渐下降,说明添加在水体里的章鱼胺对马氏珠母贝的生长产生不利影响。实验结果还表明耗氧率随着OA浓度的升高而增大,其中OA浓度最高(10-4M)的实验组耗氧率也最高,而实验组和对照组的排氨率没有显著差异。通过检测不同浓度章鱼胺（OA）对马氏珠母贝总ATP酶、酸性磷酸酶ACP、碱性磷酸酶AKP、过氧化物酶POD和总超氧化物歧化酶T-SOD活性的影响,发现其中对照组的酸性磷酸酶ACP活力显著低于添加OA的实验组（P＜0.05）;而对照组碱性磷酸酶AKP、总ATP酶、过氧化物酶POD的酶活力均显著低于添加OA浓度最高的实验组（P＜0.05）;总超氧化物歧化酶SOD的酶活力则在对照组和实验组间没有显著差异（P＞0.05）。实验结果表明,章鱼胺（OA）可以显著影响马氏珠母贝贝体的生长性状和免疫代谢能力,而总体来看在养殖水体里加入章鱼胺会对马氏珠母贝的贝壳生长和免疫代谢产生不利影响。
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