论文部分内容阅读
目的本课题拟针对痴呆的西医发病机理及中医病机开展当归芍药散(DSS)改善雌性糖尿病模型小鼠认知障碍的药理机制研究,为研制出能延缓糖尿病性痴呆进程、提高患者生活质量的中药新药提供科学依据。方法一、DSS对STZ诱导的糖尿病模型小鼠学习记忆及糖基化相关机制的研究SPF级C57/BL6雌性小鼠75只,平均10周龄。应用链脲霉素80mg/kg连续三天腹腔注射后,使用血糖检测仪检测小鼠血糖水平。小鼠在非禁食状况下的血糖水平超过16.7 mM,则定义为糖尿病小鼠。然后按照血糖和体重随机分为DSS高中低三组及模型组,每组各8只。DSS低剂量组给药剂量为1.6 g/kg·d,DSS中剂量组给药剂量为3.2 g/kg·d,DSS高剂量组给药剂量为6.4 g/kg·d。模型组及正常对照组予以灌胃等量蒸馏水,所有实验动物每次以0.1ml/10g的药液体积计算灌胃剂量,每天1次,持续8周。动物行为学实验期间灌胃仍持续进行。所有动物均饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF动物房,均单笼饲养,自由进食饮水。在给药后6周进行持续6天的Morris水迷宫试验。行为学测试结束,摘眼球法收集小鼠血清;同时,取双侧海马和皮质制作样本,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组海马和皮质组织内O-G]cNAc糖基化、0-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)及0-连接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)的表达水平。再检测雌激素受体ER α和ERβ水平。免疫荧光法检测脑内雌激素相关蛋白ER α和ERβ蛋白表达情况,HE染色和β-半乳糖苷酶染色检测脑组织切片细胞衰老和病理学变化。定量数据采用SPSS 23.0进行统计分析。二、DSS对自发型糖尿病模型db/db小鼠学习记忆及糖基化相关机制的研究SPF级雌性db/db小鼠31只,其中自发性糖尿病雌性db/db小鼠模型23只,相同月龄雌性野生型db/m小鼠8只。平均12周龄。将雌性db/db小鼠按照简单随机化的方法分成几个实验组。空白8只,模型9只,高剂量8只,低剂量6只。所有动物均饲养于SPF级广州中医药大学实验动物中心动物房,均单笼饲养,自由进食。饲养到10月龄时开始灌胃给药,给药时间持续12周。DSS低剂量组给药剂量为3.2 g/kg·d,DSS高剂量组给药剂量为6.4 g/kg·d。模型组以及阴性对照组以等量蒸馏水灌胃,所有实验动物每次灌胃的药液体积均以0.1ml/10g计算,每天给药1次。动物行为学实验期间灌胃仍持续进行,8周后行持续6天Morris水迷宫试验。行为学测试结束,摘眼球法收集小鼠血清;同时取双侧海马和皮质制作样本,Western blot检测各组海马和皮质组织内0-GlcNAc糖基化、0-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)及0-连接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)的表达水平。再检测雌激素受体ER α和ERβ水平。免疫荧光法检测脑内雌激素相关蛋白EKα和EKβ蛋白表达情况,HE染色和β-半乳糖苷酶染色检测脑组织切片细胞衰老和病理学变化。定量数据采用SPSS 23.0进行统计分析。结果一、DSS对STZ诱导的糖尿病模型小鼠学习记忆能力的影响(一)Morris水迷宫和新物体识别测试检测DSS对小鼠的学习记忆能力的影响。1.Morris水迷宫行为学结果(1)定位航行试验结果随着游泳天数的增加,小鼠的游泳时间和游泳距离呈下降趋势。实验结果显示,与正常对照组相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠游泳时间与游泳距离均明显延长(P<0.01);与模型组相比,DSS中、高剂量组小鼠游泳时间及游泳距离均明显缩短(P<0.05,P<0.01),表明DSS对于STZ诱导的糖尿病模型小鼠的学习记忆能力具有改善作用。(2)空间探索试验结果与正常组比较,STZ诱导的糖尿病模型小鼠空间探索原平台象限停留的时间明显减少(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.05);与模型组比较,DSS中剂量组和高剂量组空间探索原平台象限停留时间均明显延长(P<0.01,P<0.05)、穿越平台次数均显著增多(P<0.05)。上述结果提示DSS能改善STZ诱导的糖尿病模型小鼠的学习记忆能力。2.新物体识别实验结果在物体识别测试中,STZ诱导的糖尿病模型小鼠对新物体的分辨指数(0.24 ±0.21)较正常组小鼠(0.71±0.08)明显减低(P<0.01),DSS高剂量组(0.67 ±0.09)和中剂量组(0.6±0.08)的分辨指数较模型组明显升高(P<0.05,P<0.01)。(二)对氧化应激通路的影响:与正常组相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠脑内MDA含量增加(P<0.05),SOD活力减少(P<0.05);与模型组相比,DSS中、高剂量组SOD活力升高(P<0.05),MDA含量减少(P<0.05)。表明STZ诱导的糖尿病模型小鼠存在氧化应激水平失衡,DSS可以明显减轻模型鼠体内的氧化应激水平,保护神经元改善记忆认知。(三)对细胞衰老的影响:细胞变性衰老程度用β-半抗原染色法检测。与正常组相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠衰老细胞呈现深蓝色,且衰老细胞数量明显较多;与模型组相比,DSS中、高剂量组较模型组组织细胞蓝色变淡、偏绿色,衰老细胞明显减少。(四)对雌激素受体糖基化的影响:Westernblot结果提示:与正常组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠脑内ER α和ERβ蛋白的表达量明显减少(P<0.01);与模型组相比,DSS中剂量和高剂量组可改善模型小鼠脑内ER α和ER β蛋白的表达(P<0.05)。与正常组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠脑内OGT蛋白的表达量明显增高,OGA蛋白表达减少(P<0.05),O-GlcNAc蛋白的表达增多(P<0.05);与模型组相比,DSS中剂量和高剂量组小鼠脑内OGT蛋白的表达明显下调,OGA蛋白的表达明显增加(P<0.05),降低O-GlcNAc蛋白的表达(P<0.05)。免疫荧光染色结果提示:与正常组小鼠相比,STZ诱导的糖尿病模型小鼠脑内ER α和红色荧光代表的阳性染色颗粒明显减少,不同浓度的DSS组红色荧光增强,显示可改善模型小鼠脑内ER α的表达。二、DSS对自发型糖尿病模型db/db小鼠学习记忆的影响(一)Morris水迷宫和新物体识别测试检测DSS对小鼠的学习记忆能力的影响。1.Morris水迷宫行为学结果(1)定位航行试验结果随着游泳天数的增加,小鼠的游泳时间和游泳距离呈下降趋势。实践证明,实验中小鼠记忆的通过反复寻找平台的这一学习过程从而形成。与正常对照组db/m小鼠相比,自发型糖尿病模型db/db小鼠组游泳时间与游泳距离均明显延长(P<0.01),提示造模成功;与模型组db/db小鼠相比,DSS中、高剂量组均能缩短db/db小鼠的游泳时间及游泳距离(P<0.05,P<0.01),表明DSS能改善自发型糖尿病模型db/db小鼠的学习记忆能力。(2)空间探索试验结果与正常组db/m小鼠比较,自发型糖尿病模型db/db小鼠空间探索原平台所在的象限停留时间明显减少(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.05);提示db/db小鼠出现认知障碍。与模型组db/db小鼠比较,DSS中剂量组和高剂量组空间探索原平台所在的象限停留时间均明显延长(P<0.01,P<0.05)、穿越平台次数均显著增多(P<0.05)。上述结果提示DSS能明显改善自发型糖尿病模型db/db小鼠的学习记忆能力。2.新物体识别实验结果在物体识别实验测试中,db/db小鼠组分辨指数(0.28±0.23)较正常组db/m小鼠(0.61±0.07)明显减低(P<0.05);与模型组相比,DSS高剂量给药组对新物体的分辨指数(0.65±0.12)较模型组明显提高(P<0.05)。(二)对氧化应激通路的影响:与正常组db/m相比,自发型糖尿病模型db/db小鼠SOD活力明显下降(P<0.05),MDA含量增加(P<0.05);与模型组相比,DSS中、高剂量组SOD活力均明显升高(P<0.05),MDA含量均明显降低(P<0.05);表明DSS可以显著的减少脑内脂质过氧化水平,增加抗氧化酶活力,改善糖尿病模型脑内氧化应激状态。(三)HE染色结果:HE染色法检测小鼠脑组织,与正常组相比,自发型糖尿病模型db/db小鼠脑组织形态有明显的改变,细胞核深染,形态异常,破碎细胞明显增多;与模型组相比,DSS中、高剂量组较模型组小鼠脑组织形态的衰老程度有明显的改善。(四)对雌激素受体糖基化的影响:Western blot结果提示:与正常组db/m小鼠相比,自发型糖尿病模型db/db小鼠脑内ER蛋白的表达量明显减少(P<0.01);与模型组相比,DSS中剂量和高剂量组均可改善模型小鼠脑内ER α和ERβ蛋白的表达(P<0.05)。与正常组小鼠相比,自发型糖尿病模型db/db小鼠脑内OGT蛋白的表达量明显增高,OGA蛋白表达减少(P<0.05),0-GlcNAc蛋白的表达增多(P<0.05);与模型组相比,DSS中剂量和高剂量组均下调模型小鼠脑内OGT蛋白的表达,上调OGA蛋白的表达(P<0.05),降低0-GlcNAc蛋白的表达(P<0.05)。结论1.STZ诱导的糖尿病模型小鼠和自发型糖尿病模型db/db小鼠均是比较理想的糖尿病痴呆小鼠模型,以明显的胰岛素抵抗、学习记忆能力降低、衰老细胞数增加和氧化应激水平增加为主要表现。2.DSS中、高剂量组均能改善STZ诱导的糖尿病模型小鼠和自发型糖尿病模型db/db小鼠的学习记忆能力,低剂量DSS未能改善STZ诱导的糖尿病模型小鼠和自发型糖尿病模型db/db小鼠的学习记忆能力,表明DSS对神经系统的影响与剂量呈正相关趋势。实验研究表明DSS对神经元凋亡、雌激素水平、氧化应激损伤、ER α的异常0-GlcNAc修饰等有不同程度的调节作用,起到改善病变、延缓神经退行性疾病的发病进程的作用。因此,DSS调肝健脾法治疗糖尿病认知功能障碍有着较好的开发前景,可以调节ER α的异常0-GlcNAc修饰相关的多个信号通路或靶标,有可能为糖尿病认知功能障碍的治疗带来新的希望。