流行病学的调查发现乙肝病毒(Hepatitis B Virus, HBV)和丙肝病毒(Hepatitis C Virus, HCV)的感染,黄曲霉毒素(Aflatoxin)和过量酒精的摄入是肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)发生的主要危险因素,其中HBV和HCV慢性感染造成的HCC占了HCC总数的80%以上。从HBV或HCV造成的慢性感染到肝癌的发生,一般需要30年以上的时间。作为一种最常见的恶性肿瘤,HCC预后极差,存活率只有3%-5%。因此,如何阻止疾病的进展,降低肝硬化、肝癌的发生率和死亡率,成为医生和患者关注的焦点问题。第一部分白介素-21与肝炎病毒感染的关系目的：白介素21(IL-21)是近期研究的一个热点,已有学者对艾滋病病人以及自身免疫性肝炎患者外周血中IL-21及IL-21R进行了检测和探讨,但迄今为止没有关于HBV和HCV患者外周血中IL-21水平的报道。IL-21参与了多种自身免疫性疾病的发生,而HBV和HCV也与机体的免疫功能有着不可分割的联系。为此,本研究拟通过检测HBV和HCV感染者血清IL-21水平,同时检测其它肝功能指标、病毒载量、抗核抗体等,探讨IL-21与HBV、HCV感染的相关性。方法：采用ELISA法定量测定IL-21和抗核抗体(ANA)。肝功能指标包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)均采用全自动生化分析仪检测。ELISA方法检测HBV血清标志物即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。HBVDNA采用荧光定量PCR法。结果：1、抗核抗体ANA和白介素21对HCV患者具有保护作用。ALT<40 U/L的HCV感染者中ANA阳性率为22.4%,而ALT>40 U/L的患者阳性率为15.0%,反映ANA阳性患者大部分肝功能较好。表明自身免疫抗体的产生对肝细胞损伤有一定的保护作用,导致ALT降低,有助于控制HCV病毒的发展。高ALT组、低ALT组及对照组间AST均值与ALT均值有同步变化,部分患者的ALT较高可能也与ANA抗体水平较低有一定的关系。ALT>40U/L的HCV感染组ALT/AST比率>1,原因可能一方面是肝细胞损伤较厉害,另一方面是纤维化程度较高。本试验中ALT<40 U/L感染组、ALT>40 U/L感染组的IL-21水平均低于对照组。但相比之下,低ALT感染组的水平更高一些。可见,HCV的感染会导致IL-21表达水平降低,且IL-21水平的高低与肝细胞受损程度呈负相关,可能与HCV感染后引起的细胞免疫有牵连。证实了IL-21的存在有助于控制HCV病毒的发展,降低肝细胞损伤。本研究提示ANA的表达与IL-21的存在均能降低HCV感染者的肝细胞损伤,且ANA阳性HCV感染者的IL-21水平低于ANA阴性HCV感染者,进一步对ANA、IL-21、ALT、AST、ALB这五个变量两两间进行相关分析,结果都没有相关性。ANA与IL-21对肝细胞的保护作用应该是与其他因素共同作用的结果。2、HBsAg阳性和HBeAg阳性病毒携带者组以及肝硬化组的IL-21水平显著低于对照组,而HBsAg阳性病毒携带者组和慢乙肝组的IL-21水平却显著高于对照组。在HBV与IL-21相互关系的研究中,我们将收集的血清分为五组,分别为：健康对照组(control)、HBsAg阳性病毒携带者组(AsCs)、HBsAg阳性和HBeAg阳性病毒携带者组(AsCse)、慢乙肝组(CHB)和肝硬化组(Cir)。control、AsCs、AsCse、CHB、Cir组ALT均值依次为16.75±1.11、24.44±2.09、23.68±2.01、201.47±36.51、59.28±12.97 U/L,具有显著性差异(F=12.368,ν=122.158,P=0.000)。AST均值依次为22.24±0.72、28.23±1.27、27.53±1.37、150.82±27.40、63.83±8.98U/L,具有显著性差异(F=15.680,v=122.362,P=0.000)。ALB均值依次为47.03±0.46、45.79±0.54、46.12±0.59、43.02±0.66、39.57±0.94g/L,具有显著性差异(F=16.367,v=116.789,P=0.000)。GLO均值依次为25.57±0.62、26.61±0.61、25.94±0.65、27.96±0.48、30.70±0.65g/L,具有显著性差异(F=10.395,v=109.138,P=0.000)。TBIL均值依次为15.20±1.44、14.13±0.80、14.25±1.73、36.17±11.00、41.96±7.27μmol/L,具有显著性差异(F=4.557,ν=114.548,P=0.002)。DBIL均值依次为4.10±0.26、4.25±0.25、4.04±0.38、17.84±7.04、20.69±5.16μmol/L,具有显著性差异(F=3.518,ν=121.135,P=0.009)。而TP均值没有显著性差异(F=1.608,ν=122.766,P=0.177)。另外,AsCs、AsCse、CHB、Cir组的HBV DNA滴度(logDNA)均值依次为3.76±0.19、6.80±0.28、5.41±0.18、3.64±0.14,具有显著性差异(F=47.324, v=97.334, P=0.000)。Control、AsCs、AsCse、CHB、Cir组的IL-21均值依次为67.22±5.87、117.17±23.92、47.90±7.46、112.73±18.54、50.18±5.87pg/ml,具有显著性差异(F=5.096,ν=120.252,P=0.001)。将所有标本按照各抗原、抗体的阴、阳性分别进行分组,用t检验比较IL-21在阴阳性组间的差别。结果表明,HBsAb阴性组的IL-21水平显著高于阳性组,依次为79.55±5.73和62.30±6.35pg/ml (t=-2.016, P=0.046);HBeAg阴性组的IL-21水平显著高于阳性组,依次为90.49±10.76和66.92±5.07pg/ml(t=-1.982,P=0.049); HBeAb阳性组的IL-21水平显著高于阴性组,依次为90.06±9.94和66.50±3.93pg/ml (t=2.205, P=0.029)。将所有标本按照男性、女性分成两组,比较IL-21在两组间的差别。结果显示,女性组IL-21均值略高于男性组,但没有显著性差异(t=-0.375,P=0.708)。对所有标本的ALT和AST作双变量相关性分析,结果相关系数r=0.959,P=0.000,表明两者显著性相关,且相关关系非常密切。对所有标本的ALB和TP作双变量相关性分析,结果相关系数r=0.689,P=0.000,表明两者显著性相关。对所有标本的DBIL和TBIL作双变量相关性分析,结果相关系数r=0.988,P=0.000,表明两者显著性相关,且相关关系非常密切。对所有标本的ALB和GLO作双变量相关性分析,结果相关系数r=-0.413,P=0.000,表明两者显著性负相关。其它变量之间也有一些较弱的相关性存在,例如LogDNA与ALT之间的r=0.328,P=0.000;LogDNA与AST之间的r=0.302,P=0.000;GLO与TP之间的r=0.363,P=0.000;ALB与DBIL之间的r=0.333,P=0.000;ALB与TBIL之间的r=0.323,P=0.000等。但是,IL-21与其它变量之间不存在显著相关性。结论：1、ALT<40U/L的HCV感染者中ANA阳性率高于ALT>40 U/L的感染者,表明自身免疫抗体的产生对肝细胞损伤有一定的保护作用。2、ALT<40 U/L的HCV感染组和ALT>40 U/L感染组的IL-21水平均低于对照组,表明HCV的感染会导致IL-21表达水平降低,反过来也说明IL-21的产生有助于控制HCV病毒发展,降低肝细胞损伤。3、HBsAg阳性和HBeAg阳性病毒携带者组以及肝硬化组的IL-21水平显著低于对照组,而HBsAg阳性病毒携带者组和慢乙肝组的IL-21水平却显著高于对照组。说明HBeAg阳性乙肝患者的预后较差,也验证了IL-21的积极作用。4、所有HBV标本的ALT和AST显著密切相关(r=0.959,P=0.000),ALB和TP显著相关(r=0.689,P=0.000),DBIL和TBIL显著密切相关(r=0.988,P=0.000),ALB和GLO显著负相关(r=-0.413,P=0.000)。第二部分肝损伤相关小分子抑制剂的筛选研究目的：利用HBV DNA指标在细胞水平筛选抗HBV药物,并研究药物对HBV复制中间体的抑制效果。从胞外、胞内两个角度深入研究化合物与DNA的结合方式、对DNA的断裂作用及其抗肝癌活性,从多方面探讨其作用机制。方法：采用WST-8法检测细胞毒性,按照CCK-8试剂盒进行操作。采用HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒检测细胞内外HBV DNA。采用Western blot法检测HBcAg。采用时间分辨免疫荧光(TRFIA)法定量检测HBeAg和HBsAg水平。采用紫外吸收光谱、荧光光谱、荧光Scatchard图及黏度测定实验研究镍配合物与小牛胸腺DNA (CT DNA)的作用,琼脂糖凝胶电泳分析镍配合物与pBR322质粒DNA的作用。通过MTT法进行镍配合物体外抗肝癌活性的评估,DAPI荧光染色分析及流式细胞术检测镍配合物对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：1、化合物XLWG-54-52抑制HepAD38细胞内HBV DNA的IC50为11.87±3.94μM,抑制胞外HBV DNA的IC50为10.84±0.60μM。通过本研究确立了一个合适的细胞模型HepAD38,该模型能较稳定地表达HBsAg和HBeAg抗原,DNA复制也较高,并确定细胞培养时间为7天；建立了一套筛选抗HBV药物的方法,并筛选出了XLWG-54-52、XLWG-61-3A、XLWG-61-7、XLWG-48-6、XLWG-48-11五个能有效抑制HBV DNA的化合物；重点对其中的XLWG-54-52进行了研究,XLWG-54-52对胞内外HBV DNA均有较强的抑制作用,胞内IC50为11.87±3.94μM,胞外IC50为10.84±0.60μM；XLWG-54-52对HepAD38的半数致死浓度CC50为0.339mM;XLWG-54-52对HBeAg、HBsAg和HBcAg三种抗原均没有抑制作用。XLWG-54-52对HBV所致乙型肝炎的治疗作用可能要结合其类似物双环醇的作用机理,从它对肝损伤的保护作用入手。2、NiL配合物与小牛胸腺DNA (CT DNA)有良好的结合,且结合方式为插入模式。它还能将质粒pBR322 DNA由超螺旋形式切割成开环形式,切割效果呈剂量依赖型,切割机理为自由基机理。紫外吸收光谱法测得配合物的吸收峰伴随有明显的减色,减色率为18%,推测NiL配合物与DNA可能是以插入模式结合,计算得出结合常数Kb为2.18×105(L·mol-1)；荧光光谱实验表明随着配合物浓度的不断增加,EB-DNA复合物的荧光明显发生淬灭,验证了配合物的吡咯环插入到DNA双链之间与之结合；荧光Scatchard图进一步显示,随着DNA溶液中配合物浓度的增大,k值逐渐减小,而n值在0.190附近变化不大,说明配合物竞争性地抑制EB与DNA的结合,即以插入方式与DNA结合；黏度实验中,配合物与CT DNA发生相互作用后,随着配合物浓度的增大,DNA黏度值逐渐增加,由此可确定配合物是以插入方式与DNA作用的；DNA琼脂糖凝胶电泳的结果是,配合物能有效断裂超螺旋DNA,且随着配合物浓度的不断增大,超螺旋DNA的量逐渐减少,缺刻产物的量逐渐增多,呈明显的量效关系,配合物切割DNA的最佳反应温度为50℃；加入自由基捕捉剂后,镍配合物对pBR322 DNA的切割效果明显减弱,说明镍配合物可能是以自由基机理断裂DNA的。3、NiL配合物能有效抑制HepG2肿瘤细胞增殖,抑制效果呈剂量依赖性,抑制机理为促进细胞凋亡MTT法结果表明镍配合物对HepG2细胞有明显的抑制作用,且存在浓度依赖性,计算得出,24h、48h和72h对应的IC50分别为328.68±66.31μM、389.81±52.56μM和202.60±38.01μM,相应地,阳性对照药物cisplatin在24h、48h和72h的IC50分别为70.87±9.60μM、28.77±5.18μM和39.97±3.66μM,而5FU的IC50分别为10.35±5.78mM、5.57±0.60mM、0.54±0.21mM相比之下,镍配合物对HepG2肝癌细胞的体外抑制活性强于5-FU,但比Cisplatin弱；DAPI染色的结果显示,镍配合物处理细胞后,细胞核呈致密浓染,染色质固缩,染色体凝聚,还有些细胞核破裂形成碎片,核解体,体现了细胞凋亡的典型特征,与阳性对照药物cisplatin类似；流式细胞仪检测结果表明,随着镍配合物浓度的增加,凋亡细胞所占的百分比也逐渐增大,进一步证实镍配合物能够促进HepG2细胞的凋亡,就细胞周期而言,镍配合物处理细胞后,与空白对照组相比,S期细胞百分比明显增加,G1和G2期细胞百分比减少,且药物浓度越高,S期比例越高。表明镍配合物能阻止HepG2细胞由S期向G2期移行,使细胞阻滞于S期,且类似于顺铂的作用效果。4、四种新的磺胺类药物均能通过凋亡途径有效抑制肿瘤细胞HepG2增殖。对四种新的磺胺类药物抗肝癌的作用进行了研究,用MTT法得到四种化合物对HepG2细胞的IC50分别为31.48±1.49μM、13.19±2.15μM.20.11±1.48μM和13.05±1.69μM。用DAPI染色后,在荧光显微镜下明显观察到四种化合物促进HepG2细胞凋亡形成的碎片状细胞核及浓缩的染色质。结论：1、化合物XLWG-54-52对HepAD38细胞内外的HBV DNA都有较强的抑制效果,其IC50分别为11.87±3.94μM和10.84±0.60μM。2、紫外吸收光谱、荧光光谱实验和黏度实验证实NiL配合物与小牛胸腺DNA(CT DNA)有良好的结合,且结合方式为插入模式。DNA琼脂糖凝胶电泳实验表明NiL配合物能将质粒pBR322 DNA由超螺旋形式切割成开环形式,切割效果呈剂量依赖型,切割机理为自由基机理。3、NiL配合物能有效抑制HepG2肿瘤细胞增殖,24h、48h和72h对应的IC50分别为328.68±66.31μM.389.81±52.56μM和202.60±38.01μM。DAPI染色结果表明NiL配合物通过促进细胞凋亡抑制HepG2细胞增殖。流式细胞术实验表明NiL配合物使HepG2细胞周期阻滞于S期。4、四种新的磺胺类药物均能通过凋亡途径有效抑制肿瘤细胞HepG2增殖。对应的IC50分别为31.48±1.49μM、13.19±2.15μM、M.20.11±1.48μM和13.05±1.69μM。