研究背景：心肌缺血/再灌注损伤是体外循环心脏外科手术过程中亟待解决的重要问题，心肌细胞内钙超载是缺血/再灌注损伤的一个重要机制。因此，阐明钙超载成因以及钙超载损伤的信号转导通路将为心肌保护策略的制定提供新思路，对促进心脏外科的发展具有重要意义。实验研究发现：离体心脏经历短暂无钙液灌流（无钙灌注）后再恢复有钙液灌流（复钙灌注），可引起严重的心肌损伤，这种现象即为钙矛盾（calcium paradox），钙矛盾所致心肌损伤与复钙灌注时大量钙离子内流引起细胞内钙超载密切相关；钠钙交换体（sodium/calcium exchanger, NCX）是参与心肌钙稳态调控的重要分子，单细胞模型研究发现，反向NCX抑制剂SEA0400可拮抗钙矛盾心肌损伤，但由于单细胞和整体心脏的差异性，反向NCX在钙矛盾损伤中的作用需要进一步评价。细胞膜完整性是细胞实现生理功能的前提，α-胞影蛋白（α-fodrin）是构成细胞骨架的主要分子，对维持细胞完整性具有重要意义；细胞膜完整性的破坏是钙矛盾心肌损伤的重要原因，但钙矛盾对α-胞影蛋白的影响尚未见相关报导；已有研究表明，α-胞影蛋白是钙蛋白酶（calpain）的作用底物之一，而钙蛋白酶的异常激活有赖于细胞内钙离子水平的异常升高。据此我们推测，钙矛盾激活反向NCX，引起胞内钙超载，进一步激活钙蛋白酶，增加α-胞影蛋白的降解，破坏细胞膜的完整性，引起心肌损伤。基于以上认识，本研究着重观察以下内容：实验目的：1．明确反向NCX在钙矛盾心肌损伤中的作用。2．明确钙蛋白酶激活在钙矛盾损伤中的作用及机制。3．明确钙矛盾过程中反向NCX激活与心肌细胞内钙蛋白酶异常活化之间的关系。4．初步探索钙矛盾无钙灌注时程的长短对钙矛盾损伤机制的影响。实验方法：第一部分：反向NCX介导钙蛋白酶激活在心脏钙矛盾损伤中的作用及机制成年健康雄性SD大鼠，随机分为5组，每组8只。1．正常对照（Control）组：正常KH缓冲液灌流48min；2．钙矛盾（Ca PD）组：无钙灌注3min后复钙灌注30min；3．反向NCX抑制剂KB-R7943加钙矛盾（KBR）组：钙矛盾过程中使用KB-R7943（10μM）；4．反向NCX抑制剂SN-6（10μM）加钙矛盾（SN）组；5．钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（10μM）加钙矛盾（MDL）组。采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型，记录并分析灌流过程中心脏的血流动力学指标，包括左室舒张末压（left ventricular end-diastolicpressure, LVEDP）、左室发展压（left ventricular developed pressure, LVDP）、收缩期左室压力变化率最大值（the highest rate of change of pressuredevelopment,+dp/dtmax）和舒张期左室压力变化率最大值（the highest rate ofchange of pressure decay,-dp/dtmax）；收集灌流过程中冠状动脉循环流出液，酶联免疫吸附法测定冠脉循环流出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的含量，以LDH的释放反映心肌细胞的坏死情况；灌流结束后将心脏取下切片，三苯四唑氯盐（triphenyl tetrazolium chloride, TTC）染色，测定其心肌梗死面积；收集心脏标本，通过western blot分析肌钙蛋白I（troponin I, TnI）的降解情况；通过western blot检测与钙蛋白酶激活特异性相关的145/150KD α-胞影蛋白的含量，这一指标既能够提示钙蛋白酶活化水平的高低，又可以反映细胞膜完整性受损情况；通过western blot检测胞浆中细胞色素c的含量，作为反映细胞凋亡的指标。第二部分：无钙灌注时程长短对钙矛盾损伤机制影响的初步探索成年健康雄性SD大鼠，随机分为9组，每组8只。1．正常对照（Control）组：正常KH缓冲液灌流48min；2．3min无钙灌注钙矛盾（Ca PD₃）组：无钙灌注3min后复钙灌注30min；3．反向NCX抑制剂KB-R7943加3min无钙灌注钙矛盾（KBR+CaPD3）组：3min无钙灌注钙矛盾过程中使用KB-R7943（10μM）；4．反向NCX抑制剂SN-6（10μM）加3min无钙灌注钙矛盾（SN+CaPD3）组；5．钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（10μM）加3min无钙灌注钙矛盾（MDL+Ca PD3）组；6．5min无钙灌注钙矛盾（Ca PD5）组：无钙灌注5min后复钙灌注30min；7．反向NCX抑制剂KB-R7943加5min无钙灌注钙矛盾（KBR+CaPD5）组：5min无钙灌注钙矛盾过程中使用KB-R7943（10μM）；8．反向NCX抑制剂SN-6（10μM）加5min无钙灌注钙矛盾（SN+CaPD₅）组；9．钙蛋白酶抑制剂MDL-28170（10μM）加5min无钙灌注钙矛盾（MDL+Ca PD₅）组。采用离体大鼠心脏Langendorff灌注模型，通过分析灌流过程中心脏的血流动力学指标、冠状动脉循环流出液中LDH释放及灌流结束后心肌梗死面积，评价不同干预方法对离体心脏的损伤程度。实验结果：第一部分：反向NCX介导钙蛋白酶激活在心脏钙矛盾损伤中的作用及机制1．离体心脏经过3min无钙灌注后，30min复钙灌注的过程中无明显心脏搏动，灌流结束后，其LVEDP值显著高于对照组（Control，129.1±22.5%；Ca PD，526.8±70.3%；P <0.001），而LVDP （Control，95.0±1.2%；Ca PD，0±0%；P <0.001）、+dp/dtmax（Control，98.5±1.1%；Ca PD，0±0%；P <0.001）及-dp/dtmax（Control，97.0±2.8%；Ca PD，0±0%；P <0.001）均显著低于Control组；灌流结束后心肌梗死面积较对照组显著增大（Control，1.0±0.5%，vs. Ca PD,98.9±0.5%，P <0.001）；心肌细胞内TnI的降解显著增加（Control，36.0±2.3%；Ca PD，66.3±2.3%；P <0.001），这一结果提示：钙矛盾损伤模型建立成功。2．在钙矛盾的过程中使用反向NCX阻断剂KB-R7943，心脏的血流动力学指标较Ca PD组显著改善（LVEDP，180.6±43.1%，P <0.001vs. Ca PD组；LVDP，46.9±2.8%，P <0.001vs. Ca PD组；+dp/dtmax，53.2±5.0%，P <0.001vs. Ca PD组；-dp/dtmax，48.6±2.1%，P <0.001vs. Ca PD组），灌流结束后心肌梗死面积较Ca PD组显著缩小（2.8±0.3%，P <0.001vs. CaPD组），TnI的降解较Ca PD组显著减少（46.7±3.8%，P <0.01vs. Ca PD组）；另一种反向NCX阻断剂SN-6对抗钙矛盾损伤的作用与KB-R7943相仿，其LVEDP为169.2±34.9%（P <0.001vs. Ca PD组），LVDP为50.3±5.5%（P <0.001vs. Ca PD组），+dp/dtmax为60.7±4.3%（P <0.001vs.Ca PD组），-dp/dtmax为55.3±3.3%（P <0.001vs. Ca PD组），心肌梗死面积为2.2±0.3%（P <0.001vs. Ca PD组），TnI降解为49.3±3.3%（P <0.01vs. Ca PD组）。上述结果表明KB-R7943和SN-6均可显著对抗钙矛盾所致心肌损伤，提示：反向NCX的激活参与钙矛盾所致的心肌损伤。3．Western blot结果显示，离体灌注的大鼠心脏在受到钙矛盾损伤后，心肌组织中145/150KD α-胞影蛋白（反映钙蛋白酶活性的一个指标）的水平较对照组显著升高（Control，100.0±7.3%；Ca PD，270.9±22.1%；P <0.001），提示钙矛盾可引起α-胞影蛋白降解，破坏细胞膜完整性，且在这一过程中心肌内存在钙蛋白酶的激活；钙矛盾过程中使用反向NCX阻断剂可显著降低145/150KD α-胞影蛋白的水平（KBR，152.3±11.9%；SN，144.9±13.2%；均P <0.001vs. Ca PD组），提示：钙矛盾过程中，钙蛋白酶激活介导的α-胞影蛋白降解是反向NCX激活的一个下游事件。4．钙矛盾过程中使用钙蛋白酶抑制剂MDL-28170，与钙矛盾组比较，心脏LVDP（9.3±2.8%，P <0.01vs. Ca PD组）、+dp/dtmax（8.1±1.9%，P<0.01vs. Ca PD组）、-dp/dtmax（9.7±2.0%，P <0.01vs. Ca PD组）均显著升高，LDH释放显著减少（42.7±2.2IU/g，P <0.001vs. Ca PD组），心肌梗死面积显著缩小（26.5±2.0%，P <0.001vs. Ca PD组），表明MDL-28170可对抗钙矛盾损伤，提示：钙蛋白酶的激活是钙矛盾损伤的一个重要机制。5．钙矛盾可引起LDH释放增加（Control，7.7±0.5IU/g；Ca PD，142.2±4.3IU/g；P <0.001），反向NCX阻断剂KB-R7943/SN-6可显著减少钙矛盾所致LDH释放（KBR，30.2±3.5IU/g；SN，26.5±3.3IU/g，均P<0.001vs. Ca PD组），钙蛋白酶抑制剂MDL-28170亦可减少钙矛盾引起的LDH释放（42.7±3.2IU/g，P <0.001vs. Ca PD组），由于钙蛋白酶的激活是反向NCX激活的一个下游事件，因此，这些结果提示：反向NCX介导钙蛋白酶激活参与钙矛盾引起的心肌细胞坏死。6．钙矛盾可引起细胞色素c释放增加（Control，100±7.7%；Ca PD，203.2±10.1%；P <0.001），反向NCX阻断剂KB-R7943/SN-6可显著减少钙矛盾所致细胞色素c释放（KBR，147.5±6.7%；SN，140.7±9.8%，均P<0.01vs. Ca PD组），钙蛋白酶抑制剂MDL-28170亦可减少钙矛盾引起的细胞色素c释放（162.4±7.4%，P <0.05vs. Ca PD），结合钙蛋白酶的激活是反向NCX激活的一个下游事件，提示：反向NCX介导钙蛋白酶激活参与钙矛盾引起的心肌细胞凋亡。第二部分：无钙灌注时程长短对钙矛盾损伤机制影响的初步探索1．3min无钙灌注诱导的钙矛盾和5min无钙灌注诱导的钙矛盾，复钙灌注期间两组心脏均未出现明显搏动，两组间LVDP恢复率均为0±0%，LDH释放（Ca PD3，142.2±4.3IU/g；Ca PD₅，137.5±7.4IU/g；P>0.05）和心肌梗死面积（Ca PD3，98.9±0.5%；Ca PD₅，99.3±1.2%；P>0.05）均无显著差异,表明这两种钙矛盾对离体心脏的损伤无显著性差异。2．反向NCX阻断剂KB-R7943/SN-6对3min无钙灌注钙矛盾和5min无钙灌注钙矛盾均具有显著的抑制作用，但对抗5min无钙灌注钙矛盾的作用弱于对抗3min无钙灌注钙矛盾的作用，表现为：与KBR+Ca PD3组比较，KBR+Ca PD₅组LVDP恢复率显著降低（KBR+Ca PD₃，46.9±2.8%；KBR+Ca PD₅，0±0%；P <0.001），LDH释放显著增加（KBR+Ca PD₃，30.2±3.5IU/g；KBR+Ca PD₅，53.5±4.8IU/g；P <0.05），心肌梗死面积显著增大（KBR+Ca PD₃，2.8±0.3%；KBR+Ca PD₅，53.3±4.5%；P <0.001）；与SN+Ca PD3组比较，SN+Ca PD5组LVDP恢复率显著减小（SN+Ca PD3，50.3±5.5%；SN+Ca PD5，2.9±0.4%；P <0.001），LDH释放显著增加（SN+CaPD₃，26.5±3.3IU/g；SN+Ca PD₅，40.6±4.9IU/g；P <0.05），心肌梗死面积显著增大（SN+Ca PD₃，2.2±0.3%；SN+Ca PD5，31.2±5.7%；P <0.001）。上述结果提示：随着无钙灌流时程的延长，反向NCX的激活在钙矛盾损伤中的权重逐渐降低。3．钙蛋白酶抑制剂MDL-28170能有效对抗3min无钙灌注钙矛盾引起的心肌舒缩功能减弱、LDH释放增加和心肌梗死面积增加；MDL-28170对5min无钙灌注钙矛盾引起的LDH释放有显著抑制作用，但是对5min无钙灌注钙矛盾引起的舒缩功能减弱和心肌梗死面积增加无显著抑制作用。MDL-28170对抗5min无钙灌注钙矛盾的作用弱于其对抗3min无钙灌注钙矛盾的作用，表现为：与MDL+Ca PD₃组比较，MDL+Ca PD₅组LVDP恢复率显著降低（MDL+Ca PD₃，9.3±2.8%%；MDL+Ca PD₅，0±0%；P <0.01），LDH释放显著增加（MDL+Ca PD₃，42.7±3.2IU/g；MDL+CaPD₅，73.9±5.5IU/g；P <0.01），心肌梗死面积显著增大（MDL+Ca PD₃，26.5±2.0%；MDL+Ca PD₅，99.1±0.8%；P <0.001），提示：随着无钙灌流时程的延长，钙蛋白酶在钙矛盾损伤中的权重也逐渐降低。结论：1．首次发现，由反向NCX-钙超载-钙蛋白酶-底物分子（α-胞影蛋白）构成的信号通路是短时程无钙灌注诱发钙矛盾心肌损伤的重要机制。2．反向NCX-钙超载-钙蛋白酶通路参与短时程无钙灌注钙矛盾所致的细胞坏死和细胞凋亡。3．反向NCX阻断剂KB-R7943/SN-6及钙蛋白酶抑制剂MDL-28170均可显著抑制短时程无钙灌注钙矛盾所致的心肌损伤，表明反向NCX和钙蛋白酶可作为防治钙超载心肌损伤的靶点。4．首次观察到钙矛盾无钙灌注时程长短与钙矛盾心肌损伤严重程度无显著相关，但对钙矛盾损伤机制存在影响，随着钙矛盾无钙灌注时程的延长，反向NCX-钙超载-钙蛋白酶通路在钙矛盾损伤机制中所占的比重逐渐降低。