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扩大栽培稻遗传基础是稻作新品种改良的重要基础性工作。野生稻是栽培稻的近缘野生种，其在长期的自然选择中形成了丰富的遗传多样性，具有诸多栽培稻没有的优良性状，是栽培稻遗传改良的重要种质资源。药用野生稻(Oryzaofficinalis，2n=24)是我国仅有的3种珍稀野生稻种质资源之一，其茎杆粗壮抗倒伏，生长势强，穗大、品质优良，抗多种病虫害，是拓宽水稻遗传育种基础的重要资源。但药用野生稻基因型为CC型，与栽培稻AA型差异大，其分子遗传背景不清楚，远缘杂交转育效率极低，常规育种利用十分困难。我们在对云南药用野生稻相关性状综合鉴定研究的基础上，力图应用基因工程技术，将药用野生稻染色体(基因组)大片段DNA(60-100 kb)转入栽培稻，构建其“渗入系”，以拓宽栽培稻遗传基础；研究、发掘和利用药用野生稻优异种质基因。本文报道，以云南孟定药用野生稻为材料，构建其“渗入系”的初步研究结果。
⑴药用野生稻BIBAC文库构建。以云南孟定药用野生稻为材料，可转化双元细菌人工染色体(Binary BAC，BIBAC)为载体，DH10B为宿主菌，构建了云南药用野生稻BIBAC文库。该文库包含53760个克隆，保存在140个384孔板中。随机检测其中的50个克隆，DNA插入片段的大小分布在25-200 kb之间，平均为76 kb，空载率为6.0％，文库覆盖率为药用野生稻基因组大小的5.86倍。
⑵药用野生稻BIBAC文库混合克隆池构建。将药用野生稻BIBAC文库制备成一、二、三级混合克隆池，各级混合克隆池对应的数量依次是3360、140和14个，为大规模混合大片段DNA转化奠定了基础。同时，大幅度减少BIBAC文库中，目标片段克隆筛选的工作量。理论上，只需要做64个PCR反应，就可以从53760个克隆中找到含有目的片段的BIBAC克隆。
⑶药用野生稻BIBAC文库中，目标克隆的初步筛选。以Xa21抗病基因序列设计特异引物，利用四步PCR方法对云南药用野生稻BIBAC文库三、二、一级混合克隆池逐级进行筛选，确定了3个携带Xa21抗病基因片段的阳性克隆。表明孟定药用野生稻可能携带Xa21抗白叶枯病基因，进一步研究仍在进行中。
⑷药用野生稻大片段DNA转化栽培稻。分别提取14个三级混合克隆池的质粒DNA，分别通过电击转化到农杆菌LBA4404感受态细胞中。统计每个三级混合池质粒DNA经电击转化获得的农杆菌克隆数并保存。每次将30个左右携带有药用野生稻大片段DNA的农杆菌克隆混合，分别转化具有代表性的栽培稻品种日本晴(Nipponbare)、中花11、滇陇201、9311的成熟胚诱导的愈伤组织，共培养2.5 d后，将愈伤转移到含有50μg/ml潮霉素的筛选培养基上，筛选6-8周，获得的抗性愈伤组织经过预分化和分化成苗，得到一批抗性苗。其中，第7混合池混合大片段DNA转化获得211株日本晴抗性苗；第8混合池混合大片段DNA转化获得189株日本晴抗性苗，176株中花11抗性苗；第11混合池混合大片段DNA转化获得13株9311抗性苗。
⑸转基因水稻植株分子检测，获得“渗入系刀。分别提取第7、8、11混合池所对应的抗性苗基因组DNA，用潮霉素(hpt)基因引物和新霉素(nptⅡ)基因引物分别进行PCR检测。结果显示：日本晴抗性苗中，66％(264/400)的植株含潮霉素(hpt)基因，9.8％(39/400)的植株含潮霉素(hpt)基因和新霉素(nptⅡ)基因；中花11抗性苗中，64.2％(113/176)的植株含潮霉素(hpt)基因，8.5%(15/176)的植株含潮霉素(hpt)基因和新霉素(nptⅡ)基因；13株9311抗性苗未检测出潮霉素(hpt)基因和新霉素(nptⅡ)基因。药用野生稻混合大片段DNA在日本晴、中花11中的转化率分别为4.4%、4.2%。以BIBAC载体上T-DNA区中SacB基因5′端和nptⅡ基因5′端序列设计引物，对转化获得的含hpt和nptⅡ基因的日本晴、中花11转基因苗基因组DNA进行PCR检测，结果进一步证实了药用野生稻大片段DNA已整合进日本晴、中花11基因组中。结果表明：已获得了54(39+15)株携带药用野生稻大片段DNA的日本晴和中花11“渗入系”。目前，进一步的鉴定研究仍在进行中。
⑹筛选获得了3个携带Xa21抗病基因序列的阳性克隆；初步建立了云南药用野生稻大片段DNA“渗入系”构建的技术体系；获得了54株携带药用野生稻大片段DNA的栽培稻“渗入系”。为利用云南药用野生稻BIBAC文库，开展其相关基因的筛选、分离、克隆和大片段DNA转移奠定了良好的技术基础；为发掘利用云南药用野生稻优异性状基因提供了新的手段。