大量研究已表明手足口病(HFMD)患者中的重症及死亡病例主要是由EV71所致。自1969年美国首次从患儿的粪便中分离出肠道病毒71型(EV71)以来,世界多个国家和地区均有EV71暴发和流行的报道。近年来,HFMD的流行成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一,造成巨大的经济和社会负担。目前,临床上尚无治疗HFMD的特效药物。疫苗成为预防和控制该病的传播与流行的最有效的手段。研发有效的疫苗,探索科学合理的免疫策略,具有重大的社会意义。本课题针对北京微谷生物制药有限公司研发的新型EV71灭活疫苗(本文简称EV71疫苗)开展免疫策略关键技术的研究。【研究目的】1.确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型和免疫程序。2.评价E V 7 1疫苗诱导的免疫反应的持久性,探讨加强免疫的必要性。3.确定EV71疫苗针对EV71所致HFMD/疾病的保护效力。4.研究EV71疫苗保护效力的免疫学替代终点。5.探索EV71疫苗与其他肠道病毒之间可能存在的交叉免疫/保护作用。6.研究不同批次E V71疫苗的批间一致性。【研究方法】1.EV71疫苗的最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究采用随机双盲、安慰剂对照的研究设计,选择幼儿组(12~60月龄)600人、婴儿组(6~11月龄)600人,研究不同剂型不同剂量的EV71灭活疫苗(含佐剂160U、含佐剂320U、含佐剂640U疫苗以及无佐剂640U疫苗)的免疫原性和安全性。比较受试者接种一针次和两针次疫苗后血清抗体水平的差异及不良反应发生率,确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型及免疫程序。2.EV71疫苗免疫持久性和加强免疫研究基于最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究的队列,随访至第1针免疫后第8月和第14月进行血清检测,观察EV71疫苗诱导的抗EV71中和抗体的持久性。采用巢式随机双盲对照研究设计,在14个月时对已经完成两针次基础免疫的受试者进行再次招募入组,按2:1随机分配给予相同剂量剂型的ev71疫苗或安慰剂进行1针次加强免疫研究,比较各组受试者加强或不加强后的血清抗体反应水平差异,评价加强免疫的效果。3.ev71疫苗的保护效力研究通过采取多中心、随机、双盲、安慰剂对照优效性设计,招募6~35月龄健康婴幼儿按1:1设计随机分配以0、28天免疫程序接种ev71疫苗或安慰剂,评价免疫后的有效性和安全性。通过建立的肠道病毒病监测系统,从第56天至第14月进行12个月的病例监测随访,确定在监测期内发生的ev71所致疾病/hfmd,并通过发病密度计算疫苗的保护率。4.ev71疫苗免疫学替代终点研究基于保护效力研究队列,采用巢式病例对照研究设计,进行免疫学替代终点的研究。以确诊的ev71感染所致疾病为病例组,每个病例在发病初步确诊后按1:5的比例进行匹配,组成一个免疫学替代终点分析亚组。利用该亚组受试者第56天血清抗ev71中和抗体,计算不同中和抗体水平阈值下的特异度、灵敏度和约登指数,探索疫苗保护性的免疫学替代终点。5.ev71疫苗对其他肠道病毒交叉免疫/保护作用研究ev71与脊髓灰质炎的交叉免疫作用是基于最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究中的600名婴儿组受试者进行的。利用受试者免疫前第0天、免疫后第28天、56天的血样,在检测ev71中和抗体的同时检测抗脊髓灰质炎病毒的i、ii、iii型抗体,比较不同时间点脊髓灰质炎抗体水平的变化趋势。ev71疫苗与ca16或其他肠道病毒交叉保护作用是基于ev71疫苗保护效力研究队列,监测第56天至第14个月的随访期内所发生的由ca16或其它肠道病毒感染所致的疾病/hfmd,评价ev71疫苗对ca16或其它肠道病毒感染的交叉保护效力。6.ev71疫苗批间一致性研究在保护效力研究人群中的ev71试验疫苗组中进行巢式随机双盲的等效性研究。ev71试验组受试者将按1:1:1随机分配接种三个不同批次的含佐剂320uev71疫苗。计算任意两批次间的免疫后血清抗ev71中和抗体gmt比值,如95%ci均在0.67~1.5之间,则三批疫苗的免疫一致性成立。【研究结果】1.最佳免疫剂量、剂型和免疫程序:接种第1针后28天,含佐剂160u组的抗ev71中和抗体gmt水平为36.91、含佐剂320u组为63.14、含佐剂640u组为82.39、无佐剂640u组为70.79、安慰剂对照组为18.00。第2针免疫后28天,含佐剂160u组中和抗体gmt水平为517.65、含佐剂320u组为831.75、含佐剂640u组为1003.01、无佐剂640u组为330.34、安慰剂对照组为21.61。四个ev71疫苗组第2针后抗体gmt水平均高于安慰剂对照组,且差异有统计学意义(p<0.05)。含佐剂640u组和含佐剂320u组的两针后中和抗体水平差异无统计学意义。安全性结果显示各疫苗组与安慰剂间的总体不良反应发生率无统计学差异。接种含佐剂160u和640u疫苗的婴儿组的硬结不良反应发生率显著高于接种不含佐剂640u疫苗的婴儿。2.免疫持久性:第8个月时,含佐剂160u组、含佐剂320u组、含佐剂640u组和无佐剂640u组的抗ev71中和抗体gmt分别为95.58、130.06、146.74和65.25,与第56天水平相比出现明显下降。第14个月,含佐剂160u组、含佐剂320u组、含佐剂640u组和无佐剂640u组的抗ev71中和抗体gmt分别为199.38、246.79、281.09和144.78。含佐剂640u组的gmt水平最高,其次为含佐剂320u组和160u组,三组间差异无统计学意义。第14个月,加强一针免疫后gmt水平是两针次基础免疫后28天gmt水平的6~10倍。3.疫苗保护效力:ev71疫苗免疫后1年内,对ev71感染所致hfmd保护率为90.93%(95%ci:70.42%-97.22%),对ev71感染所致疾病保护率为81.85%(95%ci:61.46%-91.46%),对ev71感染所致hfmd住院病例保护率为100.00%(95%ci:41.56%-100.00%)。4.免疫学替代终点:免疫后第56天在抗ev71中和抗体阈值为1:16时,约登指数最大,灵敏度和特异度分别为84.6%和70.8%。其次是在抗ev71中和抗体阈值为1:32时,灵敏度和特异度分别为88.5%和66.0%。5.交叉免疫/交叉保护作用:ev71疫苗接种对婴儿受试者体内抗脊髓灰质炎病毒中和抗体水平无干扰作用。ev71疫苗对ca16感染所致疾病、非ev71非ca16的其他肠道病毒感染所致疾病和临床诊断的hfmd样疾病的保护率分别为-0.10%(95%ci-11.45-10.09)、3.98%(95%ci-2.98-10.48)、和3.16%(95%ci-6.01-11.53)。6.疫苗的批间一致性:三批次ev71试验疫苗接种人群第1针免疫后第56天抗ev71中和抗体gmt比值均在等效区间0.67~1.50内。【主要结论】1.含佐剂的ev71疫苗剂型的免疫原性优于无佐剂剂型,且两针次接种后的抗体反应水平显著高于一针次免疫后的抗体反应水平;在含佐剂的160u、320u和640u三个剂量ev71疫苗组具有一定的剂量反应关系;最终确定了含佐剂320u的最佳免疫剂量剂型及0、28天两针次免疫程序。2.通过对免疫后血清抗体水平持续观察,得出了在目前ev71自然暴露普遍的情况下无需加强免疫的结论。3.ev71疫苗对ev71所致疾病/hfmd有较高的保护效力。4.采用约登指数法进行定量分析,提出免疫后第56天抗ev71中和抗体滴度1:16~1:32为保护性免疫学替代终点。5.证实ev71疫苗对ev71以外的其他肠道病毒无交叉保护作用,与脊髓灰质炎疫苗无交叉免疫作用。6.该ev71疫苗不同批的次间一致性成立。【研究意义】本课题围绕该新型ev71疫苗免疫策略研究中的最佳免疫剂量、剂型及免疫程序选择,疫苗的保护效力、针对其他肠道病毒的交叉免疫/保护作用,疫苗的免疫持久性及加强免疫,保护效力的免疫学替代终点等关键问题,在全球首批完成了该ev71疫苗临床系列研究,以科学详实的资料全面解决了ev71疫苗临床评价中的关键技术问题,为制定ev71疫苗免疫策略及临床应用提供了科学依据,同时为同类疫苗的研发与临床评价提供了借鉴。