癌症和传染性疾病严重威胁着人类的生命健康,在癌症和传染性疾病的初期阶段,尤其是潜伏期,其生物标志物的含量非常低,发展快速且灵敏的检测方法,对癌症和传染性疾病的及时发现、预防以及治疗具有重要意义。电化学传感器具有操作简便、灵敏度高、成本低廉、易于微型化等特点而受到广泛关注。传感界面的有序性、有效的电流信号转换和放大可以显著提高传感器的灵敏度和准确度。DNA四面体是相对较为简单的纳米结构,可以为识别元件提供刚性支撑,控制识别元件之间的密度和朝向,提高其利用效率。本文将DNA四面体和信号放大技术相结合构建高效、易操作的新型电化学生物传感器,在降低背景信号的同时增大检测信号,实现对超低丰度生物标志物的高灵敏检测。主要研究工作如下:1.设计新型的双功能信使探针（DMP）并将其与DNA四面体探针（DTPs）和杂交链式反应（HCR）相结合,构建免标记型双识别扩增（LDRA）策略,用于癌胚抗原（CEA）的检测。该双功能信使探针用以代替CEA进行异质界面杂交反应和引发杂交链式反应。通过杂交链式反应后形成hemin/G-四链体（h-Gx）,将界面杂交反应定量地转化为可测量的电化学信号。DNA四面体探针作为刚性支撑,有序地修饰在电极表面,实现高效的链式杂交、显著提高目标物的可接近性、降低背景信号。该检测方法结合双重识别过程和HCR信号放大技术,实现了 CEA的高灵敏检测,检出限为18.2 fg/mL（S/N=3）,线性范围为0.1 pg/mL-50 ng/mL。此方法对临床样品CEA的检测结果与临床诊断结果一致,为临床CEA的检测提供参考。2.在实验中我们发现,由于针对不同的目标物需要重新设计合成新的DNA四面体,容易引起其纯度和产率的下降,针对这一问题我们设计合成了接枝型的DNA四面体,将目标物的识别序列转移到一条较短的桥梁探针中。利用接枝型的DNA四面体和聚腺嘌呤介导的滚动纳米机器构建稳固且高度有序的3D电化学生物传感器,用于腺苷的传感和检测。通过调节polyA-ODNs中腺嘌呤的长度控制附着在该传感器“顶部”滚动马达机器上的DNA步行链的方向和密度。将具有接枝结构的四面体DNA固定在电极表面,控制该传感器“底部”识别探针的方向和分布,以构建更加有序的传感界面。本工作提出一种新的运动模式,即目标诱导的循环滚动剪切,代替逐步剪切,提高马达机器的工作效率。另外,由识别探针和GTD杂交接枝后形成的双链DNA作为支柱,为柔软的长单链提供稳定的支撑,增加DNA链之间的可接触性,不仅提高了杂交几率,而且有助于促进催化环的形成,提高滚动剪切效率。在最佳条件下,该传感器实现了对腺苷的灵敏检测,线性范围为0.5 nM～1.5 βM,检出限为0.17 nM。该体系独特的双向调控特性显著提高了杂交概率和马达机器的运动效率,为生物传感器平台中DNA纳米机器的开发应用提供新途径。3.为了提高传感器的检测效率,缩短检测时间,实现不同目标物的同时高灵敏检测,需要构建多任务处理体系。随着任务量的增加,分析空间会变的更加有限,背景信号也会随之增大,如何进行有效的信号转换实现不同目标物的同时高灵敏检测是我们面临的问题。因此,我们基于GTD和逆向邻近连接反应以及核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）辅助的目标物循环技术,构建用于多任务处理的均相接枝型电化学生物传感器,并将其用于乙型肝炎（HBV）和人类获得性免疫缺陷综合症（HIV）的检测。该方法的线性范围为1fM～100 pM,检出限分别为0.32 fM和0.18 fM。与传统的检测策略相比,均相接枝型电化学生物传感策略不仅能高灵敏检测单一目标物,而且可以实现不同传染病DNA的同时检测。该策略有效降低了背景信号,并使捕获探针均匀分布,避免工作电极复杂而耗时的修饰过程,在传染病早期诊断中具有很大的应用潜力。4.DNA四面体不仅可以用作基底材料,还可以直接用作DNA纳米机器。DNA步行器（walker）的运动效率与其运动模式密切相关。由于半固定模式和完全自由模式下DNA纳米机器的运动效率都不理想,因此亟需开发既可以将DNA纳米机器固定于电极表面又不影响其自由运动的模式。针对以上问题,本工作设计了自由横向运动的多臂四面体DNA纳米机器（MTM）,并将其与脂质双分子层相结合,构建仿生型电化学比率传感器,用于目标物DNA的高灵敏检测。首先,在电极表面修饰脂质双分子层以构建仿生界面,进而负载MTM和修饰有二茂铁的双链轨道。MTM的其中一个顶点标记有胆固醇,另外三个顶点上悬置着被封闭的泳臂,此设计可以确保MTM保持自由移动的同时而不脱离传感系统。此外,目标物循环过程将微量的目标物转化为大量的次级启动子探针,高效触发MTM移动。亚甲基蓝标记的发夹燃料探针通过链置换反应释放MTM的泳臂,为MTM在脂质双分子层上自由移动提供持续动力。本工作提出的运动模式,提高了 DNA纳米机器的运动效率。另外,本工作所采用的双信号响应提高了目标物检测的准确性。在50 aM～10 pM范围内,两信号物的比值与目标物DNA浓度对数呈现良好的线性关系,检出限为1.2 aM。该方法在电化学检测分析方面具有应用潜力,为临床早期诊断和生物医学研究提供了新的传感平台。5.在之前的体系中我们发现,walker的连续运动,往往需要额外的能量输入,导致检测程序变得复杂。除此之外,walker过程中分支迁移的速率对其步行效率有很大影响。为此,本工作提出杂交链式walker机制,制备网格状的DNA发卡轨道,建立新型的电化学生物传感器,用于传染性疾病HBV核酸序列的检测。将杂交链式反应的发卡组件集成到与之对应的DNA四面体纳米器件中。目标物直接诱导发卡轨道发生杂交walker反应,致使信号探针发生分支迁移,离开传感界面。DNA网格四面体为发卡组件提供刚性支撑,在空间上调节其密度和朝向,使DNA轨道高度有序并保持适当的距离,有助于提高DNA探针之间的杂交效率和信号探针的分支迁移速率。该策略无酶、简单、易操作且避免了传统步行器中额外驱动组分的加入,实现对HBV的快速检测,线性范围为5 fM-100pM,检出限为1.27 fM,为多种生物标志物的灵敏检测开辟了新的途径。