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Hsa-let-7c/IGF-1R轴包括hsa-let-7c与IGF-1/IGF-1R两部分。其中,IGF轴在骨形成、矿化骨骼维持及成牙向分化方面起着重要作用,课题组前期研究证实作为IGF轴中的重要成员——IGF-1,可促进人根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)及牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成牙/成骨向分化。而Micro RNA中的let-7家族——hsa-let-7c可调控间充质干细胞的成骨向分化。有研究表明let-7表达下调后可通过IGF1信号级联反应上调IGF1R的表达,从而促进细胞的分化。目前,hsa-let-7c/IGF1R轴对SCAPs成牙/成骨向分化能力的影响尚未有文献报道。第一部分根尖牙乳头干细胞的分离培养与鉴定研究目的:分离培养获得间充质来源的根尖牙乳头干细胞研究方法:经江苏省口腔医院口腔外科患者的知情同意后,收集完整拔除的17~20岁健康人阻生第三磨牙,牙齿表面灭菌处理后,无菌条件下取出根尖牙乳头,酶消化法及有限稀释法分离培养多克隆来源的根尖牙乳头干细胞,α-MEM培养,流式细胞术(FCM)检测STRO-1、CD73、CD90、CD105等间充质干细胞标志。实验结果:流式细胞术检测结果显示SCAPs阳性表达STRO-1、CD73、CD90、CD105等间充质细胞标记物,而CD34和CD45表达为阴性。结论:经鉴定,分离出的多克隆根尖乳头细胞为间充质来源干细胞。第二部分hsa-let-7c/IGF1R轴对IGF-1介导的SCAPs增殖与定向分化能力的影响研究目的:明确hsa-let-7c/IGF1R轴对IGF-1介导的人根尖牙乳头干细胞增殖与成牙/成骨向分化能力的影响。研究方法:Hsa-let-7c过表达(Let-7c-over)、低表达(Let-7c-low)病毒分别转染SCAPs,经IGF1刺激后,采用CCK8绘制两组细胞生长曲线,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数(PI),检测hsa-let-7c与IGF1/IGF1R对SCAPs增殖能力的影响。Hsa-let-7c过表达、低表达病毒分别转染SCAPs,提取两组细胞总蛋白和RNA,蛋白免疫印迹实验(western blot)检测IGF1R表达情况,实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测hsa-let-7c表达情况。茜素红染色检测成骨诱导液诱导两组细胞14天时的钙结节形成情况,经IGF-1诱导0d,3d,7d,提取两组细胞总蛋白和RNA,蛋白免疫印迹实验(western blot)检测牙向/骨向分化相关蛋白(DMP1,DSP,ALP,COL-I,OCN,OSX,RUNX2等)的表达情况,实时定量逆转录聚合酶链反应实验(Real-time RT-PCR)检测牙向/骨向分化相关基因(DMP1,DSPP,COL-I,OCN,OSX,RUNX2等)的表达情况。实验结果:RT-PCR及western blot的实验结果表明:Let-7c-over组中hsa-let-7c表达升高,IGF1R表达下降;Let-7c-low组中hsa-let-7c表达下降,IGF1R表达明显升高。CCK8及FCM结果显示Let-7c-over+IGF1及Let-7c-low+IGF1组增殖能力没有明显差异。在成骨培养液条件下,Let-7c-low+IGF1组的矿化结节形成量较hsa-let-7c过表达+IGF1组多,差异具有统计学意义(P<0.05),Let-7c-low+IGF1组成牙/成骨向分化标志基因及蛋白表达(DMP1/DMP1,DSPP/DSP,ALP,COL-I/COL-I,OCN/OCN,OSX/OSX,RUNX2/RUNX2)在3d或7d均较Let-7c-over+IGF1组高。结论:经检测,病毒转染效果显著。Hsa-let-7c与IGF-1R表达的成反比例关系。Let-7c-over+IGF1及Let-7c-low+IGF1对其增殖能力没有显著影响。在Let-7c-low+IGF1,IGF1R表达升高状态下的SCAPs成牙、成骨能力明显上升,表明IGF1是通过IGF1R,进而调节SCAPs成牙/成骨向分化进程。路机制第三部分hsa-let-7c/IGF1R轴调控SCAPs分化的MAPK通研究目的:探讨MAPK通路在hsa-let-7c/IGF1R轴调控SCAPs分化过程中的潜在作用。研究方法:Hsa-let-7c过表达、低表达病毒分别转染SCAPs 1h,提取胞浆蛋白,western blot检测MAPK通路相关蛋白(p-ERK,ERK,p-p38,p38,p-JNK,JNK)表达情况。研究结果:Let-7c-low组中p-JNK,p-p38蛋白表达上调明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。Let-7c-over组中p-JNK与p-p38蛋白表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:MAPK通路在hsa-let-7c/IGF1R轴调控SCAPs分化过程中发挥重要作用。