前言宫颈癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤之一，是最常见的妇科恶性肿瘤。它的发生是多因素，多步骤的过程，病因至今尚未完全明了。宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视。20世纪70年代末，Zur首先提出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)为宫颈癌的病因假说。目前认为HPV是导致宫颈癌发生最主要的因素。人乳头瘤病毒(HPV)尤其是高危型HPV与宫颈癌的发生、发展密切相关。在90％以上的宫颈癌组织中可检出HPV病毒，宫颈癌细胞表达E6和E7癌蛋白。E6AP(E6 assiociated protein)是细胞编码的一种泛素蛋白连接酶，属于泛素联络酶(ubiquitin ligase)家族。E6基因是人乳头瘤病毒(HPV)尤其是高危型HPV致癌的主要基因之一，E6AP能与E6癌蛋白相结合形成E6-E6AP复合体，而且E6AP只与高危型HPVE6蛋白结合，介导E6的许多功能。E6蛋白依赖E6AP与p53蛋白核心区结合，形成复合体E6／E6AP，通过泛素依赖途径降解p53蛋白。最近发现，泛素-蛋白酶体途径与癌相关性脱调控有关，参与癌性转化、肿瘤进展、免疫监控逃逸及抗药性等真核细胞的许多代谢过程，这种途径可能是癌异常调节机制的重要靶点，因此，针对E6AP泛素连接酶基因的治疗将成为研究和治疗宫颈癌的新的作用靶点。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来人类最重大的发现，是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因静默过程，为双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。目前公认的RNAi作用机制为：生物体细胞内的双链RNA被Dicer酶识别并切割，生成21～23 nt的siRNA。这种siRNA与一系列核酸酶形成的复合物叫做RNA介导的静默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)，复合物中包括解旋酶和核酸内切酶。解旋酶将siRNA双链解开转变为活化的形式，与靶序列mRNA互补的siRNA称为反义siRNA。反义siRNA介导该活化复合物识别并结合与其特异性互补的mRNA，最终引导核酸内切酶将靶序列的mRNA切成碎片而发挥作用。检测宫颈癌组织、慢性宫颈炎组织、CIN组织中E6AP基因的表达，并分析E6AP基因与宫颈癌临床病理特征的关系及其临床意义。应用RNA干扰技术化学合成siRNA及构建短发夹状RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达质粒，研究其作用于E6AP基因后对E6AP基因mRNA及蛋白表达的影响，对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。同时对比干扰前后hTERT表达和端粒酶活性的变化，探讨E6AP与hTERT的关系。研究E6AP基因在宫颈癌发病机制中的作用和意义，为宫颈癌的基因诊断和药物治疗提供科学的实验依据。材料和方法1、半定量RT—PCR法选取2004年5月至2006年5月中国医科大学第二附属医院妇产科手术切除和活检的浸润宫颈癌标本35例，选择慢性宫颈炎组织、CIN组织各10例，按Trizol试剂盒说明进行组织总RNA的提取，逆转录成cDNA。E6AP引物序列：5’-AATCCTGCAGACTTGAAGAA-3’和5’-TCCACATTCCCTTCATACTC-3’。PCR反应体系反应条件：93℃变性1min后，以93℃30s、56℃30s、72℃45s的顺序循环30次，最后72℃延伸10min。2、体外合成siRNA模板设计采用Ambion公司提供的网上在线设计工具，每对模板长29个碱基，含与T7启动子序列互补的8个碱基和与靶基因对应的21个碱基。用Ambion SilencerTM siRNA Construction Kit合成21个碱基的正义链和反义链RNA并退火形成双链RNA。E6APsiRNA如下：Antisense：5’-UAUCUCAGAGCAGGAGUUGUU-3’，Sense：5’-CAACACCUGCUCUGAGAUAUU-3’；Non-sense control：Antisense：5’-AGGUGACUAGCACUGUUAGUU-3’，Sense：5’-GUAACAGUGCUAGUCACCUUU-3’。3、shRNA的设计和真核表达质粒的构建根据GenBank报道的E6AP序列，利用Ambion公司提供的软件设计E6AP基因的RNAi序列，中间loop环序列选用：TTCG四个碱基，两侧为与载体连接的酶切位点序列。RNAi-E6AP模板：A：5’-TCGACCAACTCCTGCTCTGAGATATTCGTATCTCAGAGCAGGAGTTGTTTTTTT A-3’：B：5’-AGCTT AAAAA AACAACTCCTGCTCTGAGA ACGAATATCTCAGAGCAGGAGTTGG-3’。RNAi-Non-sense模板：A：5’-TCGACCTAACAGTG CTAGTCACCTTTCGAGGTGA CTAG CACTGTTAGTTTTTTTA-3’：B：5’-AGCTTAAAAAAACTAACAGT GCTAGTC ACCTCGAA AGGTGA CTAGCACTG TTAGG-3’。合成DNA序列退火成双链DNA。SalⅠ／HindⅢ酶切质粒，1％琼脂糖电泳后回收载体，然后与RNAi-E6AP模板连接，获得的重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆后提取质粒，测序验证后转染细胞。4、细胞培养和质粒转染Hela细胞培养于含10％胎牛血清、1％双抗的RPMI1640培养液。利用转染试剂TransMessenger转染化学合成的siRNA。采用脂质体转染试剂Lipofectamin 2000转染质粒。5、半定量RT-PCR各组细胞加入Trizol试剂提取总RNA。反应条件为：93℃变性1min后，以93℃30s、56℃30s、72℃45s的顺序循环30次，最后72℃延伸10min。E6AP引物序列：5’-AATCCTGCAGACTTGAAGAA-3’和5’-TCCACATTCCCTTCATAC TC-3’。以β-肌动蛋白基因作为内对照，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线照相并进行分析。6、E6AP蛋白质的检测用蛋白印迹法，细胞经4％十二烷基硫酸钠(SDS)裂解，匀浆，离心，提取细胞总蛋白质。考马斯亮蓝法蛋白质定量。各组样本分别取总蛋白质300μg，经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后转PVDF膜。与特异性单克隆一抗4℃过夜。与二抗室温孵育2h后，ECL显色。7、噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖各组细胞胰酶消化，稀释成2×10~6／ml浓度，加入96孔板中，设3重复孔，培养12h，加入MTT，继续培养4h，吸去培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)，震荡5 min，继续培养30 min。在λ=570 nm处测定吸光度。8、流式细胞仪分析细胞凋亡按照Anexin V流式细胞仪检测试剂盒说明进行操作。收集细胞，在PBS中洗涤，Annexin V抗体及PI标记后，用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。9、hTERT mRNA的检测应用半定量RT-PCR法，反应条件为：93℃变性1min后，以93℃30s、55℃30s、72℃45s的顺序循环32次，最后72℃延伸10min。引物序列：5’-GTGGATGATTTCTTGTTGT-3’；5’-GCAGGAGGATCTTGTAGATG-3’，以β-肌动蛋白基因作为内对照。hTERT／β-actin光密度比值作为hTERT mRNA的表达水平。10、TRAP-PCR-ELISA细胞端粒酶活性检测，分别收集各组细胞，依据TRAP试剂盒提供的方法进行检测，每份标本同时在酶标仪上读取A450和A690吸收值，根据AA=A450-A690计算结果，△A值代表细胞端粒酶活性。结果1、通过RT-PCR技术检测组织中E6AP的表达，发现E6AP基因在慢性宫颈炎、CIN组织、癌性组织中均有表达。宫颈癌组的表达量高于慢性宫颈炎组和CIN组，差异有统计学意义(P＜0.05)。E6AP基因表达随着疾病临床分期的进展而增加，Ⅰ、Ⅱ期表达与Ⅲ期的表达相比较差异有统计学意义(P＜0.05)。而与肿瘤的类型、大小、组织分化、是否存在淋巴节转移等无关。2、体外合成特异性E6APsiRNA转染入Hela细胞系，检测干涉效果表明siRNA有效转染Hela细胞并抑制基因的表达，细胞增殖明显抑制，凋亡明显增加，hTERT基因表达明显下调，端粒酶活性明显降低，随着干涉效果的消失逐渐恢复。3、成功构建靶向E6AP基因的shRNA真核表达质粒，通过质粒测序证实合成的siRNA基因序列正确，符合要求。pNeo-RNAi-E6AP表达载体有效转染Hela细胞并抑制功能基因的表达，细胞增殖明显抑制，凋亡明显增加，hTERT基因表达明显下调，端粒酶活性明显降低。干涉后第20天，干涉效果与对照组比较差异有统计学意义，干涉时间明显延长。结论1、E6AP基因在宫颈炎、CIN及宫颈癌之间存在一定的分子生物学联系。2、E6AP基因表达随着宫颈癌临床分期的进展而增加表明E6AP基因参与了宫颈癌的发生、发展。3、E6APsiRNA可以有效的降低E6AP的表达，使细胞增殖明显抑制，凋亡明显增加，但持续时间较短。E6APshRNA可以长时间持续有效的降低E6AP的表达，使细胞增殖明显抑制，凋亡明显增加。4、hTERT的表达与端粒酶的激活作用与E6AP有关。