背景近年来,随着基因重组技术的发展,一种从分子水平治疗缺血性心脏病的新方法即“分子搭桥术”逐渐受到了人们的重视。所谓“分子搭桥术”是指用促血管生长因子诱导心肌新生血管形成,刺激心肌缺血部位的自我搭桥,从而提高心肌侧支循环的代偿能力,实现内源性心肌再血管化,以消除或减轻心肌缺血,也称为“治疗性血管新生”。目前研究最多的治疗性血管新生方法为通过载体把目的基因导入心血管组织。但由于传统的病毒载体或非病毒载体的安全性差和转染效率低等的多种不足,严重的影响了基因治疗的临床疗效,因此建立和发展高效、安全、可控、实用的基因载体系统已成为基因治疗研究的重点。近年来研究表明,不仅超声照射本身有促进基因体外和体内转染的作用,而且超声介导微泡造影剂破裂可明显增加基因的转染效率,是一种安全的基因运载系统。目前临床所用超声造影剂均为内含气体的微气泡。其外壳的成膜材料多样,包括磷脂类化合物、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解的高分子多聚物等,其内通常充入气体,包括二氧化碳、氧气、空气或大分子惰性气体(多为氟烷气体)等。由于造影剂的蛋白质或阳离子脂质体外壳通常带正电荷,而质粒通常带有大量负电荷,因此可以使目的基因粘附于微泡表面；此外,脂质外壳的微泡还可以在其表面装配不同的配体,如抗体、氨基酸、多糖等物质,这为制备具有组织特异性的靶向微泡创造了可能性。临床上常用的SonoVue微泡为含六氟化硫气体的微泡造影剂,外壳含有脂质成分。形成的微泡平均直径为2.5μm。大量资料显示,超声不仅可以使细胞膜通透性增加,而且微泡破裂后还可使微血管破裂,内皮细胞间隙增宽。Bao等[2]的研究认为：产生这些效应的主要的机制是超声的“空化效应”(cavication),所谓空化效应是指微气泡在声波作用下表现出“震荡”或“爆聚”活性,而随之形成的微流、射流和冲击波等激烈过程会使其周围的组织细胞壁被击穿,产生可逆或不可逆的小孔。由于微泡的存在又可以降低超声空化的域值。因此,通过对携带目的基因的微泡进行靶部位的超声照射,由空化效应导致的微泡破裂可以使微泡定向释放所携带的基因,同时空化效应产生的休克波会使局部毛细血管和邻近组织细胞膜的通透性增高,从而使目的基因更容易进入组织细胞内,实现并增强基因的转染和表达。利用微泡携带目的基因的方法主要有4种[3]：①将基因粘附于微泡外壳表面或包埋于外壳内；②把基因整合入微泡内部；③通过静电作用,将基因共价结合到微泡表面；④在微泡外壳中加入一层油酯物质包绕微泡,然后将疏水性药物整合入这层油酯中。目前多采用前两种方法来实现目的基因与微泡的连接。其一,将微泡与裸基因或基因载体混合后经外周血管同时注入体内,待其到达靶组织后用超声照射靶区。通过超声辐照引起的微泡破裂和局部微血管及细胞通透性的增加,促使血管内的基因进入周围组织。Shohet等[4]将腺病毒p半乳糖苷酶基因与微泡混合,再去除过量基因,获得粘附有基因的微泡,并将这种载基因微泡经静脉注入小鼠体内,进行超声辐照,4天后可检测到小鼠心肌组织中p半乳糖苷酶活性比对照组增加10倍；而若先后输入微泡和p半乳糖苷酶基因,则心肌组织中p半乳糖苷酶的活性仅比对照组增加2倍,说明基因与微泡粘附更能提高基因的转染率。其二,是将基因包裹在微气泡的内部,将微气泡制备为基因载体,当其经过外周血管注入到达靶组织时,进行超声辐照破裂微泡,使其内部的基因物质在局部释放出来。Frenkel等[5]通过超声振荡法将荧光素酶质粒整合入白蛋白微泡外壳中,并用超声辐照进行细胞的基因转染,结果显示,当DNA浓度为4000μg/ml时,微泡包载DNA组对细胞的转染率最高。靶向超声微泡的应用是进行超声分子显像的基础,而制备靶向微泡的关键技术在于微泡的表面修饰,即如何将特异性好、活性高的配体牢固结合到微泡表面。目前连接方法常用的有共价法或非共价法。其中非共价结合多通过生物素-亲和素连接技术；而共价结合多采用羧酸酯类衍生物介导配体与微泡外壳连接。ICAM-1是细胞粘附分子免疫球蛋白家族的一个成员,主要表达于活化内皮细胞和其他抗原递质细胞上,介导内皮细胞与白细胞的粘附反应。炎症细胞因子等诱发的ICAM-1表达上调及由后者介导的白细胞与内皮细胞的相互作用,是炎症反应的关键因素。缺血后多种炎性细胞因子诱导微血管内皮细胞表达ICAM-1,使其水平增高,而且内皮细胞受损后暴露了一些炎性细胞结合位点,如ICAM-1位点,微泡对这些暴露的炎性细胞结合位点可能具有某种亲和力。由于ICAM-1在正常组织中几乎不表达,所以抗ICAM-1抗体标记的靶向微泡可特异结合于受损内皮表面。Villanueva和Weller等[8,9]均发现损伤的冠脉内皮表面可粘附大量携抗ICAM-1抗体的微泡,并可据此来评价内皮细胞功能和急性心脏排斥反应。研究表明连接了特异性配体的微泡能够更好的在靶组织聚集,因此,若将靶向微泡作为目的基因的载体,则与微泡连接的特异性配体则能增强基因转染的靶向性,减少基因治疗的副作用,进一步增强基因的转染效率。ANG-1基因是血管生成素家族的一种,主要由血管周围细胞、血管平滑肌细胞和肿瘤细胞分泌表达。ANG-1在血管新生中发挥多种作用,可促进血管成熟,减少血管渗漏,维持血管的稳定性。Thurs-ton等[10]分别在ANG-1和VEGF的转基因小鼠皮肤血管内注入Evan蓝染料,对由芥子油诱发的血管炎症反应,ANG-1转基因小鼠的血管渗漏情况较VEGF转基因小鼠轻,炎症反应不明显；另外,ANG-1还能与内皮细胞上的特异性受体Tie-2氨酸激酶结合使细胞内Tie-2氨酸磷酸化形成二聚体,对内皮细胞具有强有力的特异性趋化及迁移作用。因此,ANG-1与VEGF作用于血管新生的不同环节,而且在很多方面ANG-1可以弥补VEGF的不足。实验一pEGFP-C3-hANG-1真核表达质粒的构建目的构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-C3-h ANG-1,并探寻满足基因转染实验所需大量质粒的提取方法。方法从pAAV ANG-1质粒中利用PCR技术获得两端添加HindⅢ和BamHⅠ酶切位点的hANG-1基因片段。将酶切鉴定正确的pEGFP-C3载体经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,利用定向克隆技术将hANG-1基因片段和pEGFP-C3载体进行连接,获得重组的pEGFP-C3-hANG-1,并电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞内扩增,筛选阳性克隆,经过酶切电泳鉴定和DNA测序证明所构建质粒的正确性。最后利用氯化铯密度梯度离心法大量提取重组pEGFP-C3-hANG-1质粒。结果pEGFP-C3-hANG-1质粒的单酶切和双酶切鉴定均可得到与预期条带大小相同的目的条带,hAng-1序列测定分析亦证明真核表达质粒pEGFP-C3-hANG-1构建成功,开放阅读框架正确。氯化铯密度梯度离心法可一次提取大量高纯度质粒,保证基因转染时质粒性质的一致性。结论利用基因克隆重组技术能成功将hANG-1基因克隆入pEGFP-C3载体中,构建真核表达质粒pEGFP-C3-hANG-1。实验二超声联合SonoVue微泡辐照促进pEGFP-C3-hANG-1细胞转染的条件优化和基因表达完整性的研究目的探讨超声联合SonoVue微泡介导人血管生成素(hANG-1)基因体外转染细胞时多种影响因素对转染效率和细胞生存率的影响,并确定最佳转染条件；同时观察超声联合微泡辐照对基因完整性和表达的影响。方法构建pEGFP-C3-hANG-1质粒,根据不同实验组的设计,应用相应的微泡联合超声辐照条件进行人胚肾293T细胞的pEGFP-C3-hANG-1基因转染。转染后48h,以荧光显微镜观察到绿色荧光为转染成功标志；流式细胞术检测基因转染阳性细胞率,台盼蓝染色检测细胞生存率；琼脂糖凝胶电泳检测经超声辐照后质粒的完整性；RT-PCR和Western blot技术检测hANG-1基因的mRNA和蛋白表达。结果①超声声强1.5 w／cm2,辐照时间30s,微泡浓度20%,DNA浓度15μg/ml时进行基因转染可获较好转染效率和细胞生存率；②转染体系中血清的存在并不影响转染效率和细胞生存率；③细胞悬浮状态下转染可显著提高基因转染效率,降低细胞死亡率；④最适转染条件下的超声辐照剂量不会影响质粒的完整性,且转染后的基因可正常表达mRNA并翻译目的基因的蛋白。结论超声联合微泡辐照能够提高体外细胞目的基因的转染效率,血清的存在并不影响基因的转染,转染后的基因能顺利地表达并具有正常功能。实验三携ICAM-1抗体的SonoVue微泡靶向识别受损内皮目的探讨静电吸附法制备的携ICAM-1抗体靶向微泡在体外和体内的寻靶能力。方法采用静电吸附法制备携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡。体外培养经IL-1β刺激大量表达ICAM-1的人血管内皮细胞ECV304,采用免疫荧光法检测靶向微泡与其结合能力。构建兔急性心肌梗塞模型,静脉注射携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡进行心肌造影,采用冷冻切片和免疫荧光法检测靶向微泡与受损血管内膜结合能力。结果体外实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡与刺激后ECV304细胞紧密结合,仅有少量靶向微泡与正常ECV304细胞结合。体内实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡在兔梗塞心肌受损血管内膜处粘附,仅可见少量靶向微泡在正常血管内膜处粘附。结论携ICAM-1抗体靶向微泡在体内、体外均能与受损血管内皮特异性结合,不仅有利于靶向超声造影显像,更为微泡携带药物或基因在局部定向释放开辟良好前景。