论文部分内容阅读
结核病是由结核分枝杆菌引起,至今依然是全球发病率和死亡率最高的传染性疾病之一。MicroRNA是一种内源性非编码的小RNA分子,可以通过与目标mRNA的互补配对,在转录后水平上对基因的表达进行负调控,导致靶：mRNA降解或翻译抑制。已有报道microRNA参与病毒和细菌引起的感染性疾病的发生,但是在结核感染领域里的研究还是空白。本研究致力于寻找结核感染相关的microRNA,为了明确microRNA在结核感染中表达变化情况,首先利用microRNA芯片做初步筛选。我们招募了4例活动性结核患者(ATB)和3例健康志愿者(HC),抽血分离外周血单个核细胞(PBMC),用结核特异性抗原PPD刺激4小时,设置未处理的细胞作为对照组以及本底microRNA表达检测组。芯片结果显示,在866个人的microRNA中,约有1/3在PBMC中表达,有47个microRNA在ATB和HC两组之间呈现差异表达谱,在PPD刺激下两组人群呈现不同的表达特征谱。在本底表达的一系列microRNA中,我们发现有12个microRNA在ATB和HC中表达差异具有统计学意义。我们对在芯片结果中显示表达上调的5个microRNA (miR-132*, miR-365, miR-362-3p, miR-572和miR-630)进行验证,进一步招募了36例ATB患者和36例HC健康人,用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测表达,结果证明芯片表达谱所筛选出的microRNA的可靠性。同时我们利用生物信息学的方法用MicroCosm在线工具分析了这5个microRNA可能调控的靶基因,发现它们具有共同的预测靶基因OBSCN,于是我们进一步用qRT-PCR方法检测了OBSCN mRNA的表达情况,发现OBSCN在活动性结核患者的PBMC中表达下调。我们推测OBSCN mRNA表达的下调可能和microRNA的表达上调有关。于是,我们利用pSuper系统,尝试构建5种microRNA的表达载体,成功克隆miR-365和miR-630的重组表达载体,在体外细胞转染实验中检测到相应microRNA的表达,和细胞中OBSCN mRNA的下调,但microRNA的具体调控机制还留待进一步深入。另一方面,我们用体外感染的模型,对结核PPD刺激前后microRNA的表达做进一步分析,进一步招募22例ATB患者和22例HC健康人,用qRT-PCR方法检测了特异microRNA在两组人群里经PPD刺激表达的倍数变化。发现miR-155和miR-155*在活动性结核病人中上调倍数要明显高于健康对照。虽然表达倍数和芯片结果存在一定差异,但两者的变化趋势与芯片结果一致。我们又进一步绘制了接受者操作特征曲线(ROC),发现miR-155可能有作为结核诊断潜在靶标的价值。对miR-155和miR-155*可能调控的靶基因分析可知,它们可能共同参与许多与结核感染免疫反应相关的信号通路。这些结果说明miR-155和miR-155*可能随着T细胞的激活表达上调,参与到结核引起的细胞免疫调节中；另方面,它们的表达差异能区分感染和非感染人群,具有作为结核诊断标志物的潜在应用价值。