目的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一种典型的炎症相关性肿瘤,慢性炎症的持续刺激与肿瘤的起始与发展密切相关。在肿瘤的炎症微环境中,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)是起到主要作用的炎性细胞。研究表明,在肝癌中TAMs的浸润程度与肝癌的转移关系密切。肿瘤组织中的TAMs具有异质性,根据不同的微环境信号可分化为不同的表型,这其中,M1型与M2型代表了连续分化状态的两种极端。传统认为M1型巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用而M2型巨噬细胞起到促肿瘤的作用。研究表明,在大多数恶性肿瘤中TAMs主要分化为M2型巨噬细胞,而在肝癌中,CD68+HLA-DR+的M1样巨噬细胞与CD68+HLA-DR-的M2样巨噬细胞同时存在。那么在肝癌中M1样巨噬细胞起到什么作用以及作用机制是什么?关于这方面的结论尚不明确。TIPE2为肿瘤坏死因子α诱导蛋白-8家族的一员,在维持机体免疫稳态方面发挥重要作用。缺失TIPE2的小鼠会发生严重的多器官炎症,在人体内TIPE2的表达下调与多种自身免疫病的发生有关。近年来越来越多的研究表明,TIPE2在肿瘤的发生发展过程中起到了一定作用,比如在肝癌中TIPE2的表达明显低于临近的癌旁组织。在HCC中,巨噬细胞的浸润能够促进肿瘤细胞的转移。那么,作为一种新型的免疫负调控因子,TIPE2是否在肿瘤相关巨噬细胞促进肝癌转移过程中起到抑制作用呢?这有待进一步研究。本课题首先分析了肝癌组织芯片中CD68+HLA-DR+M1样巨噬细胞的浸润与肝癌转移的相关性,并在体外将THP-1细胞诱导为M1样巨噬细胞,用其上清作为条件培养基作用于肝癌细胞,证明了M1样巨噬细胞可能具有促进肝癌细胞转移的作用,并且通过阻断肝癌细胞NF-κB通路证明了M1样巨噬细胞的促肝癌细胞转移作用可能是通过活化NF-κB/FAK通路实现的。然后通过将过表达TIPE2的肝癌细胞与THP-1来源的巨噬细胞共培养,以及单独使用TNF-a作用于过表达TIPE2的肝癌细胞,证明了TIPE2具有抑制肿瘤相关性炎症促肝癌细胞转移的作用,并且这种作用可能是通过阻断FAK通路实现的。方法—通过免疫组织化学双染方法检测肝癌组织芯片中浸润的CD68+HLA-DR+巨噬细胞的数量(1)肝细胞肝癌病人组织芯片本实验所用的肝癌组织芯片包括75例肝癌组织,购于上海芯超生物科技有限公司,并附有病人的具体资料,包括性别、年龄、有无转移、病理分型及病理分级等。所有病例根据转移情况分为两组：20例转移组(包括血管侵袭、门静脉癌栓及远处转移)以及55例无转移组。(2)通过免疫组织化学双染方法检测组织芯片中CD68与HLA-DR的表达情况利用免疫组化双染试剂盒检测厚度为4毫米的肝癌组织芯片中CD68与HLA-DR的表达情况。石蜡包埋的芯片经过脱蜡与水化后,在EDTA溶液中进行高压热修复,用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,1%BSA封闭非特异性位点后,加入一抗混合液4℃过夜。一抗混合液包括：CD68一抗(鼠抗人单克隆抗体,1：400稀释),HLA-DR一抗(兔抗人单克隆抗体,1：200稀释)。然后加入各自对应的二抗,分别为连接有辣根过氧化物酶的羊抗鼠IgG抗体及碱磷酶标记羊抗兔IgG抗体。用试剂盒中的DAB染色剂与AP-Red染色剂进行染色,并用苏木素复染细胞核,3%氨水返蓝,最后封片保存。阴性对照组为不加一抗的肝癌组织切片。(3)相关性分析于显微镜高倍镜视野下(400×)进行CD68+TAM与CD68+HLA-DR+M1样巨噬细胞的数目。每一例病例计数三个CD68表达最高的视野,取其平均值作为CD68+TAM与CD68+HLA-DR+M1样巨噬细胞的数目。将得到的数据用GraphPad Prism5.0软件进行相关性分析。二体外诱导巨噬细胞分化以及条件培养基的制备(1)体外诱导巨噬细胞分化人单核细胞系THP-1购于中国科学院上海细胞库。用RPMI1640培养基加入10%FBS,于37℃、5%CO2孵箱中培养。利用IFN-y和LPS将THP-1细胞诱导为M1样巨噬细胞,用IL-4与IL-13将THP-1细胞诱导为M2样巨噬细胞。24h后,用PBS清洗细胞,收集M1样与M2样巨噬细胞的RNA与蛋白质,用RT-PCR方法检测IL-6与TNF-a的表达情况,用Western-blot方法检测HLA-DR表达情况,以鉴定表型诱导是否成功。(2)条件培养基的制备确定细胞诱导成功后,将THP-1细胞接种至6孔板中,用IFN-y和LPS将THP-1细胞诱导为M1样巨噬细胞。24h后,用PBS彻底清洗细胞以除去加入的细胞因子,重新加入新鲜的RPMI1640培养基继续培养24h,收集上清并过滤去除残留细胞,作为条件培养基用于后续实验。三M1样巨噬细胞对肝癌细胞迁移能力以及相关细胞通路的影响(1) Trans well细胞迁移实验检测M1样巨噬细胞对肝癌细胞迁移能力的影响肝癌细胞SMMC-7721与HepG2均购于中国科学院上海细胞库,用-RPMI1640培养基加入10%FBS,于37℃、5%CO2孵箱中培养。将1×105个肝癌细胞接种至transwell小室(孔径为8μm)上室中进行细胞迁移实验,所用培养基分别为条件培养基(conditioned medium, CM)或者普通培养基(regular medium, RM),即为CM组与RM组。24h后,用结晶紫染色检测迁移情况。于显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数迁移细胞数。(2) Western-blot检测相关通路的变化情况将适量肝癌细胞接种至6孔板中,待贴壁后,更换为条件培养基继续培养,分别于12h及24h时,收取细胞蛋白,用Western-blot方法检测迁移相关通路NF-κB及FAK通路的变化情况。四Transwell细胞迁移实验检测阻断NF-κB通路后细胞迁移能力的变化情况(1)加入Bay11-7082阻断NF-κB通路后肝癌细胞迁移能力的变化情况将适量肝癌细胞接种至6孔板中,待过夜贴壁后,向培养基中加入20μM的Bay11-7082预处理1h。然后将细胞消化下来,将1×105个细胞加入到transwell小室(孔径为8μm)上室中进行细胞迁移实验。24h后,用结晶紫染色检测迁移情况。于显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数迁移细胞数。(2)用P65-SiRNA阻断NF-κB通路后肝癌细胞迁移能力的变化情况将适量肝癌细胞接种至6孔板中,待过夜贴壁后,用脂质体法向细胞中转染P65-SiRNA,24h后将细胞消化下来,将1×105个细胞加入到transwell小室(孔径为8μm)上室中进行细胞迁移实验。24h后,用结晶紫染色检测迁移情况。于显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数迁移细胞数。五用Western-blot检测阻断NF-κB通路后相关细胞通路的变化情况(1)加入Bay11-7082阻断NF-κB通路后肝癌细胞相关细胞通路的变化情况将适量肝癌细胞接种至6孔板中,待过夜贴壁后,换为含有20gM的Bay11-7082的条件培养基继续培养,分别于12h及24h收取细胞蛋白, Western-blot方法检测细胞通路的变化情况。(2)用P65-SiRNA阻断NF-κB通路后肝癌细胞相关细胞通路的变化情况将适量肝癌细胞接种至6孔板中,待过夜贴壁后,用脂质体法向细胞中转染P65-SiRNA,24h后换为条件培养基继续培养,分别于12h及24h收取细胞蛋白,Western-blot方法检测细胞通路的变化情况。六通过将过表达TIPE2的肝癌细胞与THP-1来源的巨噬细胞共培养检测肝癌细胞迁移能力以及相关细胞通路的变化情况。(1)过表达TIPE2的肝癌细胞与THP-1来源的巨噬细胞共培养本实验所用的人肝癌细胞SMMC-7721、HuH-7及人单核细胞THP-1均购于中国科学院上海细胞库,SMMC-7721细胞与THP-1细胞用RPMI1640培养基、HuH-7细胞用DMEM培养基,分别加入10%FBS培养于37℃、5%CO2孵箱中培养。本实验分为两组：共培与对照组。向肝癌细胞中分别转染TIPE2质粒与pRK-5质粒。将THP-1细胞接种于transwell小室(孔径为0.4μm)上室中,加入终浓度320nM PMA刺激其贴壁。上述两种细胞于孵箱中培养过夜,第二天清洗接种有THP-1细胞的小室以去除PMA,将小室分别放入转染了TIPE2质粒与pRK-5质粒的肝癌细胞中进行共培养,此为共培组。对照组为转染了TIPE2质粒与pRK-5质粒的肝癌细胞,未与THP-1来源的巨噬细胞进行共培养。(2)通过transwell细胞迁移实验检测肝癌细胞迁移能力的变化共培养24h后,用胰酶将肝癌细胞消化下来,用无血清培养基吹打成单细胞悬液。将1×105个肝癌细胞加至transwell小室(孔径为8μm)上室中,进行细胞迁移实验。24h后,用结晶紫染色检测迁移情况。于显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数迁移细胞数。(3)通过Western-blot检测肝癌细胞中相关细胞通路的变化共培养24h后,弃掉transwell小室,收集肝癌细胞提取总蛋白,用Western-blot方法检测肝癌细胞中P-FAK576与P-FAK861的变化情况。七用TNF-a处理过表达TIPE2的肝癌细胞检测肝癌细胞迁移能力的变化情况以及相关细胞通路的变化。(1)过表达TIPE2的肝癌细胞加入TNF-a进行刺激本实验分为两组：TNF-a处理组与对照组。向肝癌细胞中分别转染TIPE2质粒与pRK-5质粒。24h后,向肝癌细胞培养基中加入20ng/ml TNF-α;此为TNF-α处理组。对照组为转染了TIPE2质粒与pRK-5质粒的肝癌细胞,未用TNF-α进行处理。(2)通过transwell细胞迁移实验检测肝癌细胞迁移能力的变化用TNF-α处理24h后,用胰酶将肝癌细胞消化下来,用无血清培养基(吹打成单细胞悬液。将1×105个肝癌细胞接种至transwell小室(孔径为8μm)上室中,进行细胞迁移实验。24h后,用结晶紫染色检测迁移情况。于显微镜下随机选取5个视野拍照,并计数迁移细胞数。(3)通过Western-blot检测肝癌细胞中相关细胞通路的变化用TNF-α处理24h后,收集肝癌细胞提取总蛋白,用Western-blot方法检测肝癌细胞中P-FAK576与P-FAK861的变化情况。结果—在肝癌中浸润的CD68+HLA-DR+巨噬细胞数量与肝癌的转移具有相关性在肝癌组织中,共同表达CD68与HLA-DR分子的细胞为M1样巨噬细胞。在所有肝癌组织标本中,表达于胞膜与胞质中的CD68分子被染成棕色,同样表达于胞膜与胞质中的HLA-DR分子被染成红色,因此,共同表达这两种分子的M1样巨噬细胞的颜色为棕色与红色的混合。75例肝癌组织标本分为两组：转移组与无转移组。在转移组中,浸润的TAMs数目平均为每高倍镜视野57个,其中M1样巨噬细胞数目为平均每高倍镜视野45个；而在无转移组,浸润的TAMs数目平均为每高倍镜视野43个,其中M1样巨噬细胞数目为平均每高倍镜视野30个。转移组与无转移组TAMs与M1样巨噬细胞浸润数目有明显地差别(P<0.05),这些结果表明在肝癌中TAM浸润与迁移有明显的相关性。二来源于THP-1细胞的M1样巨噬细胞鉴定结果将THP-1细胞分别用LPS、IFN-γ或IL-4、IL-13诱导为M1样或M2样巨噬细胞后,经RT-PCR检测发现,M1样巨噬细胞中IL-6与TNF-α的表达明显高于M2样巨噬细胞；经Western-blot检测发现,M1样巨噬细胞中HLA-DR的表达显著高于M2样巨噬细胞。以上结果表明,本实验中的M1样巨噬细胞诱导成功。三M1样巨噬细胞促进肝癌细胞的迁移Transwell迁移实验结果表明,CM组的肝癌细胞迁移数目要明显高于RM组,这说明,M1样巨噬细胞可以促进肝癌细胞的迁移。四M1样巨噬细胞通过NF-κB/FAK通路促进肝癌细胞的迁移Western-blot检测结果表明,在12h或24h时,CM组的肝癌细胞中P-P65与P-FAK的表达要显著高于RM组的肝癌细胞。这表明,M1样巨噬细胞可能通过NF-κB/FAK通路作用于肝癌细胞。五阻断NF-κB通路后肝癌细胞的迁移能力降低在上述的transwell细胞迁移实验中,CM组肝癌细胞的迁移能力要明显高于RM组。然而,当在CM组的条件培养基中加入Bay11-7082后,与CM组相比这种迁移增强作用被减弱。同理,用P65-SiRNA干扰肝癌细胞NF-κB通路后得到了与上述一致的实验结果。转染了NC-SiRNA的CM组肝癌细胞的迁移能力要明显高于转染了NC-SiRNA的RM组,然而转染了P65-SiRNA的CM组肝癌细胞的迁移能力要明显低于转染了NC-SiRNA的CM组。以上结果表明,M1样巨噬细胞的促迁移作用通过P65的沉默表达被阻断。六阻断NF-κB通路后肝癌细胞中相关细胞通路的变化情况在上述的Western-blot实验中,CM组肝癌细胞中P-P65与P-FAK的表达要显著高于RM组的肝癌细胞。当在CM组的条件培养基中加入Bay11-7082处理12h或24h后,肝癌细胞中P-P65与P-FAK的表达下调。同理,转染了NC-SiRNA的CM组肝癌细胞中P-P65与P-FAK的表达要显著高于转染了NC-SiRNA的RM组,然而转染了P65-SiRNA的CM组肝癌细胞中P-P65与P-FAK的表达要低于转染了NC-SiRNA的CM组。七TIPE2抑制了THP-1来源的巨噬细胞或者TNF-a对肝癌细胞的促迁移作用以及对肝癌细胞FAK通路的活化作用(1)对照组中肝癌细胞过表达TIPE2对细胞迁移无明显影响Transwell细胞迁移实验结果显示,未与巨噬细胞共培养的对照组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞与转染了TIPE2质粒的肝癌细胞,迁移能力均较低且无明显差异(P>0.05)。(2)共培组中肝癌细胞过表达TIPE2可明显抑制细胞迁移与对照组相比,共培组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞迁移能力明显升高,这表明巨噬细胞促进了肝癌细胞的迁移。然而,当肝癌细胞过表达TIPE2再与巨噬细胞共培养后,发现巨噬细胞促进迁移的现象被抑制。以上结果表明,TIPE2可能在巨噬细胞促进肝癌细胞迁移的过程中起到了抑制作用。(3)对照组中肝癌细胞过表达TIPE2对细胞中FAK通路蛋白的表达无明显影响Western-blot结果表明,对照组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞与转染了TIPE2质粒的肝癌细胞,P-FAK576与P-FAK861的表达均较低且无明显差异(P>0.05)。(4)共培组中肝癌细胞过表达TIPE2可明显抑制FAK通路的活化与对照组相比,共培组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞中,P-FAK576与P-FAK861的表达明显升高,这表明巨噬细胞激活了肝癌细胞中FAK通路。然而,当肝癌细胞过表达TIPE2再与巨噬细胞共培养后,发现P-FAK576与P-FAK861的表达降至较低水平。这表明TIPE2在肝癌细胞中的表达可能抑制了由巨噬细胞引起的FAK通路的活化。八TIPE2可抑制TNF-a对肝癌细胞的促迁移作用以及对肝癌细胞FAK通路的活化作用(1)对照组中肝癌细胞过表达TIPE2对细胞迁移无明显影响Transwell细胞迁移实验结果显示,未用TNF-α处理的对照组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞与转染了TIPE2质粒的肝癌细胞,迁移能力均较低且无明显差异(P>0.05)。(2)TNF-α刺激组中肝癌细胞过表达TIPE2可明显抑制细胞迁移与对照组相比,转染了pRK-5质粒并用TNF-α处理的肝癌细胞迁移能力明显升高,这表明TNF-α促进了肝癌细胞的迁移。然而,当肝癌细胞过表达TIPE2再用TNF-α处理后,发现TNF-α促进迁移的现象被抑制。以上结果表明,TIPE2可能在TNF-α促进肝癌细胞迁移的过程中起到了抑制作用。(3)对照组中肝癌细胞过表达TIPE2对细胞中FAK通路蛋白的表达无明显影响Western-blot结果表明,未用TNF-α处理的对照组中转染了pRK-5质粒的肝癌细胞与转染了TIPE2质粒的肝癌细胞,P-FAK576与P-FAK861的表达均较低且无明显差异(P>0.05)。(4)共培组中肝癌细胞过表达TIPE2可明显抑制FAK通路的活化与对照组相比,转染了pRK-5质粒并用TNF-α处理的肝癌细胞中P-FAK576与P-FAK861的表达明显升高,这表明TNF-α激活了肝癌细胞中FAK通路。然而,当肝癌细胞过表达TIPE2再用TNF-a处理后,发现P-FAK576与P-FAK861的表达降至较低水平。这表明TIPE2在肝癌细胞中的表达可能抑制了由TNF-α引起的FAK通路的活化。结论一M1样巨噬细胞通过活化肝癌细胞中NF-κB/FAK通路的表达促进肝癌细胞转移。二TIPE2抑制了巨噬细胞以及TNF-a的促肝癌细胞迁移作用,并且这种抑制作用可能是通过抑制肝癌细胞中FAK通路的激活实现的。