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上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首,严重影响女性健康。由于缺乏特异性的肿瘤标志物及早期症状,超过70%的EOC患者在诊断时已经处于晚期。目前,EOC的主要治疗方法是手术+铂类为基础的化疗。近年来,虽然PARP抑制剂等辅助治疗策略也被应用于EOC,但晚期EOC患者的5年生存率仍然徘徊在30-40%之间,近40年来改善甚微。因此,迫切需要寻找能够揭示EOC发生、发展的深层次分子机制,为EOC的诊断及新的治疗方法的开发提供理论基础。随着肿瘤免疫学的发展,免疫治疗已成为与手术、化疗、放疗并列的第四种治疗方式。免疫疗法的应用已经彻底改变了一些肿瘤的治疗模式,其中针对免疫检查点分子的治疗,如CTLA-4和PD-1等,在黑色素瘤、肾癌、霍奇金病和肺癌中取得了令人兴奋的结果。但是,针对现有免疫检查点的免疫治疗的整体有效率较低。更为严重的是,包括卵巢癌、结直肠癌在内的多种肿瘤,在很大程度上对CTLA-4或PD-1阻断剂无效。因此,需要对其它的免疫检查点分子进行详细研究,以开发新的免疫检查点药物及筛选对免疫治疗有效的人群,提高免疫治疗的效果。TIM-3蛋白是T细胞免疫球蛋白-粘蛋白家族（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein,TIM）的成员,最初发现在Th1细胞上特异表达,其编码基因位于人类chr5q33,全长23kb,由7个外显子组成。后续研究发现:TIM-3可在多种免疫细胞中表达,如单核细胞、DCs、NK细胞等天然免疫细胞,并参与免疫细胞功能的调控。大量的肿瘤免疫学的研究表明:TIM-3不仅可以通过调控T细胞耗竭和抑制骨髓细胞增殖在肿瘤免疫中发挥负性调节作用,而且可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞表型的转化来调节抗肿瘤免疫反应。正如Romero博士在综述《Immunotherapy:PD-1 says goodbye,TIM-3says hello》所说的:TIM-3在肿瘤免疫中发挥重要的免疫检查点作用。因此,TIM-3作为一种潜在的肿瘤免疫治疗候选药物靶点,已经占据了突出的地位。近年来,多项研究也表明TIM-3在肿瘤细胞中过表达,如黑色素瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、宫颈癌、肾透明细胞癌、骨肉瘤等,并通过参与IL-6/STAT3通路、TGF-β/Smad通路和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）等过程促进肿瘤侵袭转移,而且TIM-3的异常表达与患者不良预后相关。先前有学者研究发现,在卵巢癌患者外周血CD4+和CD8+T细胞中TIM-3的表达水平较正常人相比显着升高,而TIM-3高表达的患者的临床分期和肿瘤分级显著高于低表达的患者。进一步研究显示,TIM-3在卵巢癌患者的肿瘤浸润性Tregs中高表达与患者预后不良有关。因此,TIM-3可能在EOC发生发展中起重要作用,可能成为EOC的潜在治疗靶点。但是,目前关于TIM-3在EOC肿瘤细胞中表达情况及在EOC肿瘤发生发展中的作用和机制及其与EOC预后的关系仍不明确。阐明TIM-3表达与EOC肿瘤发生发展的关系及可能的作用机制,有助于加深对EOC发病机制的了解及新的治疗靶点开发,同时可以为EOC高危人群的筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。本研究中,我们首先探讨TIM-3蛋白及mRNA在EOC肿瘤组织中的表达情况,并分析其与EOC临床病理特征及预后的关系。其次通过体外实验在细胞水平研究TIM-3对EOC细胞生物学行为的影响及其可能的机制。另外,我们还通过病例-对照研究,探讨TIM-3基因上rs10053538、rs10515746及rs1036199三个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）位点与EOC发病风险及预后的关系,意义在于探讨TIM-3基因上的可能的功能性遗传变异是否通过改变其表达而改变人群EOC的发病风险和患者的临床预后,这也可能为EOC高危人群筛查和免疫治疗疗效的预测提供新的分子标志物。第一部分TIM-3在上皮性卵巢癌组织中的表达及其预后关系的研究目的:探讨TIM-3在EOC组织中的表达与EOC患者临床病理特征及其预后的关系。方法:1.采用免疫组化检测46例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3蛋白的表达差异。2.RT-qPCR法检测126例EOC组织及21例正常卵巢组织中TIM-3 mRNA的表达情况,分析TIM-3 mRNA表达与EOC临床病理特征及预后的关系;并通过在线网站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）查阅TCGA数据库中TIM-3 mRNA在卵巢癌与正常卵巢组织中的表达情况。3.采用多色免疫荧光技术检测135例EOC组织中TIM-3蛋白的表达情况,并分析TIM-3蛋白表达情况及在肿瘤区域TIM-3蛋白表达与EOC患者临床病理特征及预后的关系。结果:1.TIM-3蛋白在EOC组阳性率76.1%（35/46）明显高于正常卵巢组23.8%（5/21）,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.EOC组织中TIM-3 mRNA的相对表达量明显高于正常卵巢组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。TCGA数据库中卵巢癌组织中TIM-3 mRNA的表达也显著高于正常卵巢组织（P<0.05）;EOC组织中TIM-3 mRNA高表达患者肿瘤复发风险（HR=2.43,95%CI=1.47-4.04,P=0.001）和死亡风险（HR=1.84,95%CI=1.10-3.08,P=0.021）与低表达患者相比均明显增加。3.EOC组织中TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化及手术残留情况密切相关（P<0.05）;肿瘤区域（即CK+区域）TIM-3蛋白的表达与EOC临床分期、分化密切相关（P<0.05）。4.Cox多因素分析显示EOC组织中TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.99,95%CI=1.29-3.08,P=0.002）和死亡风险（HR=2.13,95%CI=1.37-3.30,P=0.001）与低表达患者相比均明显增加;CK+区域TIM-3蛋白高表达患者肿瘤复发风险（HR=1.64,95%CI=1.09-2.46,P=0.018）和死亡风险（HR=1.81,95%CI=1.19-2.75,P=0.006）与低表达患者相比均明显增加。结论:1.TIM-3蛋白及mRNA在EOC组织高表达。2.TIM-3表达与EOC临床分期、分化等临床病理因素相关。3.EOC组织中TIM-3 mRNA和蛋白高表达是患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。第二部分TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:探讨TIM-3对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制,明确TIM-3在EOC恶性化进程中的作用及机制,为EOC的靶向治疗奠定理论基础。方法:1.筛选TIM-3高表达细胞株:RT-qPCR及western-blot技术检测人卵巢癌细胞SKOV3、A2780、OVCAR3及人正常卵巢上皮细胞IOSE80中TIM-3的表达。2.采用脂质体转染法构建TIM-3低表达卵巢癌细胞系,CCK-8法及平板克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,流式细胞技术检测细胞凋亡情况的变化,划痕实验及transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。3.Western-blot技术检测转染后EMT及TGF-β/Smad信号通路的变化。结果:1.SKOV3、A2780、OVCAR3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白均高于IOSE80细胞（P<0.001）,其中SKOV3细胞中TIM-3 mRNA及蛋白高于A2780、OVCAR3细胞（P<0.05）。2.LVRU6GP-TIM-3-sh RNA治疗转染SKOV3细胞后,TIM-3的mRNA及蛋白表达水平显著低于转染空质粒组（P<0.05）,CCK-8及平板克隆形成实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞的增殖率显著降低（P<0.05）,流式细胞实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞凋亡率显著增加（P<0.05）,划痕实验及transwell小室实验结果显示,敲低TIM-3表达后SKOV3细胞迁移及侵袭能力显著降低（P<0.05）。3.在SKOV3-sh组细胞中E-cadherin的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P=0.006）;而SKOV3-sh组细胞中N-cadherin和Vimentin的表达明显低于SKOV3-NC组细胞（P=0.014、P=0.002）。SKOV3-sh组细胞Smad7及磷酸化Smad2（p-Smad2）的表达明显高于SKOV3-NC组细胞（P<0.001、P=0.002）,而两组细胞中Smad2的表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.敲低TIM-3的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迀移,并促进其凋亡。2.敲低TIM-3表达抑制卵巢癌细胞EMT过程,可能与TGF-β/Smad信号通路有关。第三部分TIM-3基因多态性与上皮性卵巢癌遗传易感性及临床预后的关联研究目的:探讨TIM-3基因多态性与EOC遗传易感性及其患者临床预后的关系。方法:1.采用我们课题组标本库的710例EOC患者和700例健康女性的外周血DNA标本,通过聚合酶链反应/连接酶检测反应（polymerase chain reaction/ligase detection reaction,PCR-LDR）方法对TIM-3基因上的3个SNPs位点（rs10053538、rs10515746和rs1036199）进行基因分型,分析不同基因型与EOC患者发病风险及预后的关系。2.采用RT-qPCR检测分别携带TIM-3两个位于启动子区的SNPs位点（rs10053538和rs10515746）不同基因型EOC肿瘤组织中TIM-3mRNA的表达水平,分析其对TIM-3 mRNA表达的影响。3.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析TIM-3 mRNA对EOC患者的预后价值。结果:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746和rs1036199的的基因型和等位基因型频率分布在病例组和对照组无统计学差异（P>0.05）。2.预后分析显示携带rs10053538 CA+AA基因型患者的PFS和OS较CC基因型患者明显减少（HR=1.49,95%CI=1.05-2.09,P=0.024;HR=1.57;95%CI=1.09-2.26,P=0.017）;而携带rs10515746CC和rs1036199AA不同基因型的患者的PFS和OS均无统计学差异（P>0.05）。3.RT-qPCR结果显示携带rs10053538 CA+AA基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量显著高CC基因型的患者（P=0.006）,而携带rs10515746不同基因型的EOC患者癌组织中TIM-3 mRNA的表达量则无明显差异（P>0.05）。4.应用Kaplan-Meier plotter数据库分析显示TIM-3 mRNA高表达与EOC患者差的PFS和OS相关（HR=1.57,95%CI=1.29-1.91,P<0.001;HR=1.31,95%CI=1.06-1.63,P=0.013）。结论:1.TIM-3基因rs10053538、rs10515746、rs1036199 SNPs与EOC发病风险无关。2.rs10053538 SNP与EOC患者的临床预后相关,携带rs10053538CA+AA基因型是EOC患者肿瘤复发及死亡的独立危险因素。3.rs10053538可能是一个功能性的多态性位点。4.TIM-3 mRNA高表达与EOC患者的不良临床预后相关。