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研究背景百日咳是由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)感染引起的一种疫苗可预防的急性呼吸道传染病,是儿童呼吸道感染最为常见的疾病之一,病程常可持续几个星期甚至更久。其典型的临床表现为阵发性痉挛性咳嗽。百日咳毒素(PT-IgG)抗体是百日咳特异性抗体,接种疫苗和自然感染免疫后不可终身免疫,无免疫力的人群普遍易感,婴幼儿及儿童感染后病情较成年人严重。近年来,全球百日咳重现,发病率呈上升趋势。有研究认为,我国的百日咳发病率可能被严重低估,可能高达95%的感染者未被诊断,特别是青少年和成人病例较以往明显增多,未发现的感染者是导致百日咳流行的极大隐患。长期以来,百日咳虽然表现为婴幼儿发病,但发病症状不典型和传播模式的改变,显示了以青少年及成人传播给婴幼儿为主,而健康从业人员的人群很大程度上代表了成人人群的百日咳感染和携带的情况,同时针对百日咳鲍特菌检测流感样病例,可了解婴幼儿和儿童中百日咳的感染情况,对婴幼儿可能感染和发病有较好的预警作用。百日咳鲍特菌传统的检测技术主要包括病原菌培养、血清毒素抗体检测和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time,rPCR)检测百日咳特异性基因IS481,由于培养敏感性低,而血清抗体检测适用于百日咳既往感染的诊断和接种疫苗后抗体的效果评价,rPCR检测方法虽然敏感性和特异性都较高,但在实际应用过程中,因标本采集、运输等环节导致的咽拭子含菌量减少会影响核酸检测的敏感性,尤其是在进行健康人群带菌调查时仍存在不足。基于上述原因,本课题在现有的rPCR检测方法的基础上,进一步建立巢式聚合酶链反应(Nested PCR,nPCR)结合rPCR的检测方法应用于百日咳鲍特菌的检测,同时结合血清学检测方法以随州市办理健康证的从业人员及临床疑似百日咳病例和流感样病例为研究对象,对湖北省随州市百日咳感染及流行现状进行调查研究。研究目的采用现况研究,以随州市办理健康证的从业人员、流感样病例及临床疑似百日咳病例为研究对象,了解随州市人群百日咳感染现状和发病情况,研究其流行特征,为今后百日咳监测和防控提供基础信息。研究方法针对百日咳鲍特菌特异基因IS481设计合适的外引物并优化反应条件,建立nPCR结合rPCR的方法,并结合已有的血清抗PT-IgG抗体检测方法开展随州市人群百日咳的感染及流行现状研究。结果(一)本研究建立的nPCR结合rPCR的方法分别检测肺炎链球菌ATCC49619、流感嗜血杆菌M5216、金黄色葡萄球菌ATCC35923、肺炎支原体12039、卡他莫拉菌ATCC25240、脑膜炎奈瑟菌CMCC29061、霍氏鲍特菌ATCC700053、副百日咳鲍特菌ATCC15311、支气管炎鲍特菌ATCC10580、百日咳鲍特菌ATCC9797,除百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌外,其他均呈阴性,说明针对鲍特菌属的检测,本方法特异性较高。测定百日咳鲍特菌ATCC9797核酸浓度并调整至10ng/μl倍比(10倍)稀释后在荧光定量PCR仪上进行扩增反应,两种方法的检测效率不同,rPCR的检测下限结果为10-4ng/μl,而nPCR结合rPCR方法的检测下限为10-6ng/μl,且后者的Ct值更小。两种方法相比,本研究建立的方法敏感性更高,可用于调查人群百日咳鲍特菌的感染率,同时为临床百日咳的诊断提供依据。(二)354份流感样病例咽拭子标本共有流感病毒阳性124份,对所有的流感样病例应用本次研究建立的方法共检出百日咳鲍特菌阳性17例,其中流感病毒阳性标本中检出百日咳鲍特菌8份,流感病毒阴性标本中检出百日咳鲍特菌9份,而单独针对百日咳鲍特菌的rPCR方法检测流感病毒阳性标本,检出百日咳鲍特菌1例,流感病毒阴性标本中未检出百日咳鲍特菌。34份临床疑似百日咳病例中检出百日咳鲍特菌阳性12例。508名健康从业人员抗血清PT-IgG抗体检测阳性18名,近期感染率为3.54%,几何平均浓度(GMC)为 4.67IU/ml。人群中抗 PT-IgG 抗体浓<5 IU/ml 占 50.98%(259/508),而国际上常认为人群中百日咳抗PT-IgG抗体浓度<5 IU/ml时为易感人群,以27～36岁人群易感性最高,抗体阳性率为4.40%,GMC为3.59IU/ml。各年龄组之间、地区之间及性别之间抗体阳性率无显著性差异;几何平均浓度(GMC)在地区之间及性别之间无显著性差异,但在各年龄组之间有显著性差异。说明随州市人群中百日咳易感性较高,有发病流行的潜在危险。(三)监测临床疑似百日咳病例,首次发现一起由成人感染百日咳传播给婴幼儿导致的家庭聚集性发病。结论建立的nPCR结合rPCR方法敏感性和特异性均较高,优于rPCR,可用于人群百日咳的感染率调查,研究发现,湖北省随州市人群中存在百日咳的感染和流行,人群抗体水平较低,百日咳的易感性较高,有潜在的发病风险,与随州市每年的法定传染病报告系统报道的数据相比较,百日咳感染和流行情况存在低估和漏报,成人感染百日咳传给婴幼儿导致家庭聚集性发病的传播模式,应该引起重视,防止百日咳的传播流行。