猪乙脑病毒又称日本脑炎病毒（JapaneseEncephalitisVirus，JEV）可引起流行性乙型脑炎，是一种重要的人兽共患病，已被世界卫生组织列为需要重点控制的传染病。因此，研究和建立抗乙脑病毒转基因猪新品种具有重要的理论和实践意义。本研究以体细胞核移植技术构建转抗乙脑病毒转基因猪为总体目标，进行了供核细胞的培养、供核细胞的基因转染和转基因重构胚的构建等方面的研究。　　 1.供核细胞的培养。从妊娠大白母猪采取体长10-15cm猪胎儿，采集背部皮肤，用组织块法培养法获得原代培养细胞并进行传代培养，细胞传至第7代，生长状态良好，生长曲线是典型的“S”型，获得了纯化的胎儿成纤维细胞。　　 2.供核细胞的基因转染。外源质粒DNA为携带抗乙脑病毒基因的PGPU6/GFP/Neo质粒载体，基因转染用脂质体LipofectamineTM2000介导。取第5-7代细胞进行抗猪乙脑病毒质粒DNA转染，当质粒DNA的量设定为0.35、0.7、1.05和1.4μg时，转染效率分别为12.75％、36.82％、24.12％和8.85％;当脂质体体积设定为0.7、1.4、2.1、2.8和3.5μl时，转染效率分别为13.08％、21.71％、37.15％、24.21％和9.21％;当转染时间设定为2.5、4.5、6.5和8.5h时，转染效率分别为3.97％、38.48％、17.54％和12.47％。这些结果表明，2.1μl脂质体介导0.7μg质粒DNA转染4.5h转染效率最高。　　 3.转基因重构胚的构建。采用化学辅助法将37～39h成熟培养的卵母细胞去核为受体细胞，胎儿成纤维细胞为供体细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中，然后电脉冲联合6-DMAP融合/激活重构胚。当电场强度设定为1.2、1.5、1.8、2.0kv/cm时，1.5kv/cm组的融合率、卵裂率和囊胚率分别为70.89％、68.75％和16.87％，显著(P＜0.05)高于其它试验组;当脉冲时间设定为30、50、80μs，50μs组的融合率、卵裂率和裘胚率分别为71.53％、70.82％和56.93％，显著(P＜0.05)高于其它试验组，而且死亡率较低(12.22％);当电脉冲设定为1、2和3DC时，1DC组的融合率、卵裂率和囊胚率分别为71.5％、63.62％和19.33％，显著(P＜0.05)高于其它试验组。这些结果表明，1.5kv/cm、50μs、1DC时重构胚的胚胎发育效果最佳。转基因重构胚经过电脉冲联合6-DMAP融合/激活后，获得融合率73.02％、卵裂率66.30％、囊胚率13.11％，获得74.74％阳性囊胚率。