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抗菌肽(antibacterial peptides,ABP)是生物机体为对抗外源性病原体及恶性细胞,由免疫防御系统非专一性应答产生的一类小分子活性肽类的总称。抗菌肽通常是由10-50个氨基酸组成的小分子多肽,具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性低等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望开发为新一代肽类抗生素。两栖动物生活环境复杂,时刻受外界微生物以及各种病菌的威胁,同时裸露且湿润的皮肤加剧了被微生物和病菌感染的风险,为了抵御这种风险,它们的皮肤分泌物中含有多种能够抵御微生物侵袭的多肽——抗菌肽。抗菌肽多为小分子多肽,其水溶性好,免疫原性低,结构稳定性强,同时具备广谱的抗菌活性,而对动物体内的正常细胞影响较小。另外,由于抗菌肽主要作用机制是破坏细菌细胞膜结构稳定性进而使质膜通透性增大,最终达到抑菌或杀菌效果,通过这样的机制使病原微生物不容易对其产生抗药性,这使其有望成为替代抗生素药物的首选研究对象。抗菌肽Dybowskin-2CD Ya(accession no.:EU827809)是在本实验室前期工作中从东北林蛙皮中分离鉴定得到的一条新型富含精氨酸的阳离子多肽(SAVGRHGRRFGLRKHRKH),该肽是一条新型肽,不同于已报道的蛙类抗菌肽,除序列特异性外,还具有正电荷多、等电点高、亲水性强等特点。其结构预测分析以及氨基酸分布显示,Dybowskin-2CDYa为一类对细菌膜有高亲和性的阳离子α-螺旋抗菌肽,由于富含精氨酸,其带正电荷数和氢键数更高,与细菌膜表面结合能力更强,推测其具有的更强抑的菌活性。有望开发成为一种新的抗感染类药物。为进一步了解新型肽D-2CDYa的生物学特性,本实验根据抗菌肽Dybowskin-2CDYa的基因序列,考虑大肠杆菌密码子偏好性,成熟肽A+T的含量等因素设计四条引物,利用SOE-PCR方法获得D-2CDYa全长基因,连接到原核表达载体pET-30a上,构建了 pET-30a-Dybowskin-2CDYa原核重组表达质粒,重组质粒转化BL21(DE3)plsS宿主,然后用PCR方法鉴定重组菌株。阳性转化子经37℃,1 mM IPTG诱导表达后,分别取诱导1～4h的菌体进行SDS-PAGE分析,结果显示在在分子量为7KDa处有蛋白特异表达。用His标签抗体进行Western Blot检测,证明目的蛋白成功表达。扩大培养重组菌,诱导表达,收集菌体,4℃超声破碎,12000 rpm离心15 min,收集上清,按His-Tag Purification kit亲和层析柱操作说明书进行His融合蛋白的纯化。纯化的重组蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约7 KDa的目的蛋白条带。扫描分析显示,其纯度达90%以上。用纯化后的蛋白进行抑菌活性检测,显示出抗菌肽Dybowskin-2CDYa对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均有抑制作用,且无明显溶血现象。本文研究结论:利用原核表达体系能够正确表达东北林蛙皮肤抗菌肽Dybowskin-2CDYa基因,SDS-PAGE及His标签抗体检测表明目的蛋白已表达。抗菌肽Dybowskin-2CDYa对革兰氏阴性菌(大肠杆菌),革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抑制活性,且无明显的溶血现象。本研究为进一步研究抗菌肽Dybowskin-2CDYa的杀菌及抑瘤的作用机理提供了稳定的样品来源。