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背景:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一种最常见的骨骼原发实体恶性肿瘤,多见于儿童和青少年,60%左右的骨肉瘤患者年龄在25岁以下。根据美国癌症协会的统计数据,美国每年大约有1000例新诊断为骨肉瘤的病例。骨肉瘤的原发部位为股骨远端(43%)、胫骨近端(23%)和肱骨(10%)。该疾病恶性程度高,具有高复发性、高侵袭性及高转移率等特点,治疗方法包括手术切除、化疗、放疗以及联合治疗。20世纪80年代初,该病的长期存活率从不到20%提高到65%。此后,在改善骨肉瘤的诊断和治疗方面没有取得重大进展。目前,转移性骨肉瘤患者存活率仍然只有10-20%,预后非常差。因此,进一步了解OS恶性进展机制将有助于开发新的治疗药物,从而提高OS患者的生存率,并降低其复发率。近年来,随着高通量测序技术地不断完善和发展,出现了很多新的测序技术类型,如甲基化RNA免疫沉淀测序技术(Me RIP-seq),让越来越多的研究者们对RNA甲基化的研究产生了兴趣。N6-甲基腺苷(m6A)是在真核细胞中发现的最常见的RNA修饰,在多种生物学过程中发挥重要作用。近年来,已有多项研究报道m6A修饰在不同类型肿瘤的发生发展中发挥重要作用。Alk B同系物5 RNA去甲基化酶(ALKBH5)是一种m6A去甲基化酶,能特异性地使RNA中的m6A去甲基化,其表达失调引起的m6A修饰失平衡与多种肿瘤进展相关。在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肾癌及膀胱癌中,均有研究表明ALKBH5表达失调可影响肿瘤的增殖、转移及侵袭。近期已有关于ALKBH5在骨肉瘤中的研究,但学者们对于ALKBH5在骨肉瘤中所发挥的作用仍有争议,且ALKBH5在骨肉瘤中的具体机制尚不明确。因此,ALKBH5在骨肉瘤发生发展中的确切作用值得进一步研究。E2F家族作为转录因子是细胞周期调控网络中的重要成员,在细胞增殖、凋亡及损伤修复等生物学过程中发挥重要作用,并对肿瘤的发生发展有着非常复杂的调控作用。根据研究报告已知E2F家族共用8位成员(E2F1-8),其中,E2F7和E2F8是E2F家族中最后发现的2位成员。目前对于E2F8的功能仍知之甚少,但已有研究表明E2F8在肝癌、肺癌、乳腺癌和甲状腺癌等肿瘤中表达上调。由此,我们可推断E2F8可能与肿瘤密切相关。然而,目前没有任何人报道过E2F8在骨肉瘤中的相关研究。因此,研究E2F8对骨肉瘤功能的影响及其在骨肉瘤机制中所发挥的作用极具创新意义,E2F8将有可能成为骨肉瘤治疗的新靶点。本项研究联合Me RIP-seq技术和RNA测序技术(RNA-seq)挖掘ALKBH5下游的靶基因,E2F8是潜在的靶点。众所周知,PI3K/AKT通路是一种细胞内信号转导途径,通过信号级联放大效应响应细胞外信号,在广泛的生理和病理过程中起着关键作用。该通路的关键基因是丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)和人磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K),PI3K/AKT通路的命名就是这么来的。在肿瘤中,PI3K/AKT通路直接或与其他信号通路协同诱导促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,如TEAD4通过PI3K/AKT通路促进膀胱癌细胞的生长和转移。目前已有大量证据表明,骨肉瘤的恶性进展与PI3K/AKT通路的异常调节有关,如ZIP10、Mi R-451、circ_001422等通过PI3K/AKT通路促进骨肉瘤细胞增殖和转移。这些研究都表明PI3K/AKT通路与骨肉瘤细胞功能有密切的联系,因此,本研究拟通过PI3K/AKT通路激活剂(740Y-P)和抑制剂(LY294002)调控通路活性,进而探索影响骨肉瘤恶性表型的具体机制。综上所述,本研究将首先阐明ALKBH5与骨肉瘤功能的相关性,然后明确ALKBH5介导E2F8/PI3K/AKT信号轴影响骨肉瘤恶性表型的分子机制。第一部分:ALKBH5抑制骨肉瘤增殖、转移和侵袭的功能研究目的:(1)明确ALKBH5在骨肉瘤组织与瘤旁组织、人成骨细胞和骨肉瘤细胞系中的表达差异;(2)阐明ALKBH5在体内外对骨肉瘤增殖、迁移及侵袭功能的影响。方法:(1)通过Western bolt(WB)和RT-qPCR检测骨肉瘤组织、瘤旁组织、人成骨细胞(h FOB1.19)和骨肉瘤细胞系(Saos2、U2-OS、143B、MG-63)中ALKBH5的基础表达情况;(2)构建ALKBH5敲减质粒(sh-ALKBH5)/阴性对照质粒(sh-NC)、过表达质粒(OE-ALKBH5)/空载质粒(Vector-ALKBH5),并通过Western bolt和RT-qPCR验证其有效性;(3)在骨肉瘤细胞系中(U2-OS、MG-63)分别转染ALKBH5阴性对照质粒、敲减质粒和过表达质粒,通过cck8实验检测细胞增殖能力,通过Transwell实验(Invasion/Migration)及划痕(Wound-healing)实验检测细胞的侵袭和迁移能力;(4)通过慢病毒在骨肉瘤细胞系(143B)中构建ALKBH5敲减效果的稳转细胞系(143B,Lv-sh ALKBH5)及阴性对照细胞系(143B,Lv-sh NC),构建ALKBH5过表达效果的稳转细胞系(143B,Lv-OE)及阴性对照细胞系(143B,Lv-Vector),然后在裸鼠皮下构建皮下成瘤模型,并通过尾静脉注射构建裸鼠尾静脉肺转移模型,通过瘤体检测、肺结节检测和免疫组化实验来判断ALKBH5对骨肉瘤成瘤和转移能力的影响。结果:(1)ALKBH5的基础表达在骨肉瘤组织中低于瘤旁组织,在骨肉瘤细胞系(Saos2、U2-OS、143B、MG-63)中低于人成骨细胞(h FOB1.19);(2)质粒转染效果满意;(3)sh-NC组的骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力低于sh-ALKBH5组,Vector-ALKBH5组的骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力高于OE-ALKBH5组;(4)相较于Lv-sh NC组,Lv-sh ALKBH5组中的成瘤效果更好、瘤体体积及重量更大、肺转移结节更多,相较于Lv-Vector组,Lv-OE组中的成瘤效果更差、瘤体体积及重量更小、肺转移结节更少。结论:(1)ALKBH5在骨肉瘤中低表达;(2)ALKBH5对骨肉瘤有抑癌作用,在体外可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力;(3)ALKBH5可在体内抑制骨肉瘤的侵袭和转移能力。第二部分:ALKBH5依赖m6A修饰下调E2F8抑制骨肉瘤恶性表型的功能研究目的:(1)通过Me RIP-seq与RNA-seq联合分析筛选出下游靶基因;(2)明确ALKBH5对骨肉瘤细胞总体m6A水平的影响;(3)明确ALKBH5对E2F8的m RNA中m6A水平的调控作用;(4)明确ALKBH5依赖m6A修饰调控E2F8的表达;(5)阐明ALKBH5在体内外调控E2F8影响骨肉瘤增殖、转移和成瘤的能力。方法:(1)在骨肉瘤细胞系(U2-OS)中构建3对OE-ALKBH5实验组与Vector-ALKBH5对照组,送入联川公司进行Me RIP-seq联合RNA-seq分析,根据测序结果的差异基因进行富集分析得到ALKBH5下游靶基因;(2)根据m6A试剂盒测骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中总体m6A水平,在骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)中转染阴性对照质粒(NC-ALKBH5)、敲减质粒(sh-ALKBH5),分别检测各组细胞中的m6A总体水平;(3)分别在sh-NC组和sh-ALKBH5组中,通过Me RIP-q PCR检测骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)里E2F8 m RNA的m6A富集变化,然后在sh-NC组/sh-ALKBH5组中通过WB实验明确ALKBH5对E2F8的调控关系;(4)通过SRAMP数据库预测E2F8的m6A位点(motif),将位点送Promega公司构建pmi GLO质粒(WT质粒,插入E2F8的3’UTR区),并让公司突变E2F8 m6A位点,构建突变体质粒(Mut1、Mut2、Mut3),然后分别在sh-NC组和sh-ALKBH5组中,通过双荧光素酶实验验证E2F8 m6A位点突变体的位置(WT-E2F8、Mut1-E2F8、Mut2-E2F8、Mut3-E2F8);(5)通过RT-q PCR检测人成骨细胞(h FOB1.19)和骨肉瘤细胞系(Saos2、U2-OS、143B、MG-63)中E2F8的基础表达情况;(6)构建E2F8敲减稳转病毒(Lv-sh E2F8)/阴性对照病毒(Lv-sh NC),在骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)中分别构建阴性对照组(Lv-sh NC)、ALKBH5敲减稳转病毒组(Lv-sh ALKBH5)、E2F8敲减稳转病毒组(Lvsh E2F8)及同时转染sh ALKBH5+sh E2F8组,先通过RT-q PCR实验验证E2F8在各组中的表达,再通过cck8实验检测细胞增殖能力,并通过Transwell实验(Invasion/Migration)及划痕(Wound-healing)实验检测细胞的侵袭和迁移能力;(7)通过慢病毒在骨肉瘤细胞系(143B)中构建阴性对照病毒组(143B,sh NC)、ALKBH5敲减稳转病毒组(143B,Lv-sh ALKBH5)、E2F8敲减稳转病毒组(143B,Lv-sh E2F8)及同时转染sh ALKBH5+sh E2F8组,先通过RTq PCR验证E2F8的稳转敲减效果,然后在裸鼠皮下构建皮下成瘤及肺转移模型,通过检测瘤体大小、重量及动物成像荧光值来判断ALKBH5、E2F8及ALKBH5+E2F8对骨肉瘤成瘤能力的影响。结果:(1)根据测序所得差异基因进行的富集分析结果显示E2F8为ALKBH5下游靶基因;(2)m6A总体水平在成骨细胞中比骨肉瘤细胞中低,而sh-ALKBH5组中细胞m6A总体水平比NC组中的高,ALKBH5对骨肉瘤细胞m6A水平有抑制作用;(3)Me RIP-q PCR实验表明,E2F8的m6A富集水平sh-ALKBH5组比shNC组高,WB结果提示ALKBH5负向调控E2F8的表达;(4)SRAMP数据库预测E2F8的m6A位点在E2F8的3’UTR区高度富集,双荧光素酶实验证实了Mut2-E2F8和Mut3-E2F8为m6A位点,都在3’UTR;(5)E2F8的基础表达在骨肉瘤细胞系(Saos2、U2-OS、143B、MG-63)中都高于人成骨细胞(h FOB1.19);(6)骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力在Lv-sh E2F8组低于Lv-sh NC组,在sh ALKBH5+sh E2F8组高于Lv-sh ALKBH5组,ALKBH5负向调控E2F8抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,通过sh E2F8的回复可降低sh ALKBH5对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用;(7)相较于Lv-sh NC组,Lv-sh E2F8组中的成瘤效果更差、瘤体体积更小、重量更轻;相较于Lv-sh ALKBH5组,sh ALKBH5+sh E2F8组中的成瘤效果更差、瘤体体积更小、重量更轻。相较于Lv-sh NC组,Lv-sh E2F8组中的肺转移荧光值更小;相较于Lv-sh ALKBH5组,sh ALKBH5+sh E2F8组中的肺转移荧光值更小。结论:(1)在骨肉瘤中E2F8为ALKBH5下游靶基因;(2)ALKBH5可下调骨肉瘤细胞中的m6A水平;(4)E2F8在骨肉瘤中高表达,ALKBH5负向调控E2F8依赖m6A修饰;(4)ALKBH5调控E2F8的m6A修饰位点在m RNA的3’UTR区;(5)ALKBH5负向调控E2F8抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力;(6)ALKBH5/E2F8可在体内抑制骨肉瘤的成瘤及转移能力。第三部分:ALKBH5/E2F8调控PI3K/AKT通路抑制骨肉瘤恶性表型的机制研究目的:(1)明确ALKBH5/E2F8对PI3K/AKT通路的调节;(2)明确ALKBH5调控PI3K/AKT通路影响骨肉瘤增殖、迁移及侵袭的功能;(3)阐明E2F8调控PI3K/AKT通路影响骨肉瘤增殖、迁移及侵袭的功能。方法:(1)在骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)中分别构建阴性对照组(Lvsh NC)、ALKBH5敲减稳转病毒组(Lv-sh ALKBH5)、E2F8敲减稳转病毒组(Lv-sh E2F8)及同时转染sh ALKBH5+sh E2F8组,通过WB验证PI3K、pPI3K、AKT、p-AKT在各组中的表达变化;(2)在骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)中分别构建阴性对照组(Lvsh NC)、ALKBH5敲减稳转病毒组(Lv-sh ALKBH5)及sh ALKBH5+LY294002组,通过cck8实验检测细胞增殖能力,再通过Transwell(invasion)实验和划痕实验(wound-healing)检测细胞的侵袭和迁移能力;(3)在骨肉瘤细胞系(U2-OS、MG-63)中分别构建阴性对照组(Lvsh NC)、E2F8敲减稳转病毒组(Lv-sh E2F8)及sh E2F8+740Y-P组,通过cck8实验检测细胞增殖能力,再通过Transwell(invasion)实验和划痕实验(wound-healing)检测细胞的侵袭和迁移能力。结果:(1)PI3K、AKT的表达在各组中无明显改变,而p-PI3K、p-AKT的表达在Lv-sh ALKBH5组高于Lv-sh NC组、Lv-sh E2F8组低于Lv-sh NC组、sh ALKBH5+sh E2F8组低于Lv-sh ALKBH5组;(2)骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力在Lv-sh ALKBH5组高于Lvsh NC组,在sh ALKBH5+LY294002组低于Lv-sh ALKBH5组,PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)可降低sh ALKBH5对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的促进作用;(3)骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力在Lv-sh E2F8组低于Lv-sh NC组,在sh E2F8+740Y-P组高于Lv-sh E2F8组,PI3K/AKT通路激活剂(740Y-P)可减轻sh E2F8对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用。结论:(1)ALKBH5可抑制PI3K/AKT通路,E2F8可激活PI3K/AKT通路;(2)ALKBH5通过抑制PI3K/AKT通路减弱骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力;(3)E2F8通过激活PI3K/AKT通路促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。