研究背景及目的:心肌炎是一种严重且可能危及生命的疾病,它会导致扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy,DCM）、严重的心力衰竭（Heart Failure,HF）和心源性猝死,临床工作中迫切需要有效的治疗药物。心肌炎的特征是心脏内的复杂炎症反应,病毒感染作为常见病因会引发心脏特异性自身免疫反应,导致自身免疫性心肌炎（Autoimmune myocarditis,AM）。临床上约21%的急性心肌炎患者会发展为DCM,持续的心肌免疫损伤是DCM发生发展的关键要素,免疫损伤机制的阐明并阻断其进展具有重要的临床价值。AM的发病机制非常复杂,目前仍未完全阐明其发病机制,临床上没有形成统一有效的治疗方案。已有研究提示铁死亡参与调控心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注、心肌纤维化的病理过程,铁死亡是否参与AM的发病过程,尚未见文献报道。既往研究提示泛素-蛋白酶体系统可参与调控胰腺癌、缺血再灌注、肿瘤干细胞的铁死亡过程。泛素连接酶E2E2（Ubiquitin-conjugating enzyme E2E2,UBE2E2）作为泛素-蛋白酶体系统家族的一员,是否参与调控AM的铁死亡水平,尚未见文献报道。本研究将通过构建实验性自身免疫性心肌炎（Experimental autoimmune myocarditis,EAM）体内外模型,揭示AM是否存在铁死亡现象以及UBE2E2是否参与调控AM的铁死亡水平,探究UBE2E2调控铁死亡改善AM心肌损伤的分子机制,为临床治疗AM提供潜在的靶点。材料与方法:一、UBE2E2、铁死亡在EAM体内外模型中的作用1、体内实验（1）采用猪心肌肌球蛋白构建EAM体内模型,将Balb/c小鼠随机分为模型组（n=8）、对照组（n=8）。（2）心脏苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）评估心肌损害情况。（3）实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q RT-PCR）检测UBE2E2在EAM模型小鼠心肌组织中的信使核糖核酸（Messenger ribonucleic acid,m RNA）的表达,检测心肌组织中铁死亡相关标记物的m RNA表达,如谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（Acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4）、铁蛋白重链1（Ferritin heavy chain,FTH1）、环氧化酶2（Cyclooxygenases-2,COX2）。（4）蛋白免疫印迹试验（Western blot）检测心肌组织中UBE2E2的蛋白表达,检测心肌组织中铁死亡相关标记物如GPX4、FTH1、COX2、ACSL4的蛋白表达。（5）酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中的炎性因子如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis fact,TNF-α）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）的水平以及心肌组织中亚铁离子水平。2、体外实验（1）采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）构建EAM体外模型,分为:对照组、模型组。（2）Western blot和q RT-PCR检测心肌细胞中UBE2E2、铁死亡相关蛋白及m RNA表达,如GPX4、FTH1、COX2、ACSL4。（3）ELISA检测心肌细胞内亚铁离子及心肌细胞上清中TNF-α、IL-1β的水平。二、过表达UBE2E2在EAM体内外模型中的作用1、体内实验（1）采用猪心肌肌球蛋白构建EAM小鼠模型,将Balb/c小鼠随机分为4组:对照组（n=8）、模型组（n=8）、模型+过表达空载组（n=8）、模型+UBE2E2过表达组（n=8）,其中模型+过表达空载组、模型+UBE2E2过表达组通过腺病毒过表达。（2）心脏HE染色评估心脏损害情况。（3）超声心动图检测各组中小鼠左心室收缩期后壁（Posterior wall-systolic,PW-s）、左心室缩短分数（Fractional shortening,FS）、左心室舒张期后壁（Posterior wall-diastolic,PW-d）、左心室射血分数（Ejection fraction,EF）等指标评估UBE2E2过表达对小鼠心脏结构和功能的影响。（4）Western blot和q RT-PCR检测铁死亡相关蛋白及m RNA表达,如UBE2E2、GPX4、FTH1、COX2、ACSL4、HMGB1。（5）ELISA检测血清中心肌损伤标记物血清肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-MB,CK-MB）、天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）的水平;检测炎性因子TNF-α、IL-1β的水平;检测心力衰竭标记物脑钠肽（Brain Natriuretic Peptide,BNP）的水平;检测抗心肌肌球蛋白抗体（Anti-cardiac myosin antibody,AMA）的水平;检测心肌组织中亚铁离子水平。2、体外实验（1）采用LPS构建心肌炎细胞模型,具体分组为正常对照组、模型组、模型+过表达空载组、模型+UBE2E2过表达组。（2）细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测各组心肌细胞增殖变化。（3）流式细胞实验检测各组心肌细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）变化。（4）线粒体膜电位免疫荧光法（JC-1法）检测线粒体膜电位。（5）透射电镜检测线粒体形态变化。（6）Western blot和q RT-PCR检测铁死亡相关蛋白及m RNA的表达,如UBE2E2、GPX4、FTH1、COX2、ACSL4、HMGB1。（7）ELISA检测心肌细胞内亚铁离子,心肌细胞上清中TNF-α、IL-1β的水平。三、探究UBE2E2抑制心肌细胞铁死亡的分子机制1、采用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）及蛋白质谱技术分析UBE2E2与HGMB1的相互作用关系。2、通过CO-IP实验分析HGMB1、泛素化Ubiquitin的蛋白表达水平。3、将小鼠心肌细胞HL-1分为对照组、对照组+MG-132处理组、UBE2E2过表达组、UBE2E2过表达+MG-132处理组,按上述分组转染UBE2E2过表达质粒及相应空载质粒到细胞中,之后采用5u M的MG-132处理细胞,24h后,Western blot检测各组细胞中目的蛋白HMGB1的表达情况。结果:一、UBE2E2、铁死亡在EAM体内外模型中的作用1、体内实验（1）HE染色:对照组小鼠的心肌纤维排列整齐,无明显病变现象;模型组小鼠HE染色提示:心肌组织中炎症细胞浸润增加,心肌细胞出现坏死崩解及水肿变性,部分心肌断裂,出现心肌纤维化。（2）QRT-PCR/Western blot:与正常对照组相比,模型组小鼠心肌组织中UBE2E2 m RNA和蛋白表达显著下调（p＜0.05）,明确UBE2E2在EAM中低表达。（3）QRT-PCR/Western blot:与正常对照组相比,模型组小鼠心肌组织中铁死亡负向调控因子GPX4、FTH1的m RNA和蛋白表达显著下调（p＜0.05）,而铁死亡的正向调控因子COX2、ACSL4的m RNA和蛋白表达显著上调（p＜0.05）。（4）ELISA:与正常对照组相比,模型组小鼠心肌组织中的亚铁离子水平升高（p＜0.05）,血清中的TNF-α、IL-1β水平升高（p＜0.05）。2、体外实验（1）Western blot和q RT-PCR:与正常细胞组相比,模型组心肌细胞GPX4、FTH1、UBE2E2蛋白及m RNA表达下调（p＜0.05）,COX2、ACSL4蛋白及m RNA表达上调（p＜0.05）。（2）ELISA:与正常细胞组相比,模型组心肌细胞内亚铁离子,细胞上清中TNF-α、IL-1β的水平升高（p＜0.05）。二、过表达UBE2E2在EAM体内外模型中的作用1、体内实验（1）HE染色:对照组心肌纤维排列整齐,无明显病变现象;模型组心肌纤维排列紊乱,心肌细胞损伤,胞质溶解,淡染;过表达空载组肌纤维排列紊乱,炎性细胞浸润,存在纤维化现象;与模型组相比较,UBE2E2过表达组肌纤维结构有所改善,炎性浸润现象明显好转。（2）心脏彩超:与正常对照组小鼠相比,模型组中小鼠的左心室PW-s、PW-d、EF和FS都有显著性下降（p＜0.05）;与模型组小鼠相比,UBE2E2过表达组小鼠的左心室EF、FS、PW-s及PW-d都有显著性上升（p＜0.05）。（3）Western blot和q RT-PCR:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠心肌组织中UBE2E2、GPX4、FTH1蛋白及m RNA低表达（p＜0.05）,HMGB1、COX2、ACSL4蛋白及m RNA高表达（p＜0.05）;与模型组小鼠相比,模型+UBE2E2过表达组UBE2E2、GPX4、FTH1蛋白及m RNA高表达（p＜0.05）,HMGB1、COX2、ACSL4蛋白及m RNA低表达（p＜0.05）。（4）ELISA结果:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠中亚铁离子、CK-MB、AST、TNF-α、IL-1β、BNP、AMA水平升高（p＜0.05）;与模型组小鼠相比,UBE2E2过表达组小鼠中亚铁离子、CK-MB、AST、TNF-α、IL-1β、BNP、AMA水平降低（p＜0.05）。2、体外实验（1）CCK8:与正常对照组相比,模型组中心肌细胞增殖活力下降（p＜0.05）;与模型组相比,UBE2E2过表达组细胞增殖活力上升（p＜0.05）。（2）流式检测:与正常对照组相比,模型组心肌细胞ROS水平显著上升（p＜0.05）;与模型组相比,UBE2E2过表达组心肌细胞中ROS水平显著下降（p＜0.05）。（3）JC-1法检测线粒体膜电位:与正常对照组相比,模型组心肌细胞线粒体膜电位水平下降（p＜0.05）;与模型组相比,UBE2E2过表达组心肌细胞线粒体膜电位水平上升（p＜0.05）。（4）透射电镜:对照组线粒体结构清晰,线粒体嵴完整,数量较多;较对照组,模型组线粒体数量减少,线粒体形态变小,嵴断裂甚至消失;过表达空载组与模型组无明显差异,线粒体减少,存在线粒体嵴断裂消失;UBE2E2过表达组线粒体数量较模型组增多,形态趋于正常,线粒体嵴清晰可见。（5）Western blot和q RT-PCR:与对照组相比,模型组心肌细胞中UBE2E2、GPX4、FTH1蛋白及m RNA低表达（p＜0.05）,HMGB1、COX2、ACSL4蛋白及m RNA高表达（p＜0.05）;与模型组心肌细胞相比,模型+UBE2E2过表达组UBE2E2、GPX4、FTH1蛋白及m RNA高表达（p＜0.05）,HMGB1、COX2、ACSL4蛋白及m RNA低表达（p＜0.05）。（6）ELISA:与正常细胞组相比,模型组中亚铁离子、TNF-α、IL-1β的水平升高（p＜0.05）;与模型组相比,模型+UBE2E2过表达组中亚铁离子、TNF-α、IL-1β的水平下降（p＜0.05）。三、探究UBE2E2抑制心肌细胞铁死亡的分子机制1、质谱手段筛选出UBE2E2蛋白下拉的产物,经分析后发现,UBE2E2可以靶向结合高迁移率族蛋白B1（High mobility group box1,HMGB1）。2、与对照组相比,UBE2E2过表达组Input中HGMB-1的蛋白表达量下调,泛素化Ubiquitin表达上调。Co-IP中检测结果显示,UBE2E2过表达后,HGMB1的表达量下调、泛素化Ubiquitin表达上调。3、与对照组相比,对照组+MG132处理组细胞中HMGB1蛋白表达更高（p＜0.05）,UBE2E2过表达组细胞中HMGB1蛋白表达更低（p＜0.05）;与UBE2E2过表达组相比,UBE2E2过表达+MG132处理组中HMGB1蛋白表达更高（p＜0.05）。结论:1、EAM存在铁死亡现象。2、UBE2E2可以靶向结合HMGB1。3、UBE2E2过表达可以通过泛素化来降解HMGB1,调控铁死亡相关蛋白表达,抑制心肌细胞的铁死亡进程,减轻心肌免疫损伤,延缓心脏舒缩功能障碍,从而对EAM的心肌细胞产生保护作用。