两性离子固定相是指固定相的配基分子中同时含有正电荷中心和负电荷中心。两性离子固定相以其卓越的色谱性能被广泛应用于无机离子、有机离子、极性小分子和多肽等物质的色谱分析,但是这类两性离子固定相在反相模式中尤其是对生物大分子的分析仍罕见报道。本文以组氨酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽为配基合成了二种两性离子固定相,对这类固定相的色谱性能进行表征,研究了蛋白质在这类固定相上的保留机理,并应用于实际蛋白样品的分析。全文包括以下四个部分:1.文献综述对近年来文献报道的各类型的混合模式色谱进行了简要介绍。综述了以两性离子为配基的混合模式色谱固定相的研究进展以及实际应用。2.以组氨酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽为配基的三种混合模式色谱固定相的制备及其色谱性能的表征分别将组氨酸、半胱氨酸和还原型谷胱甘肽键合到硅胶表面,成功制备了一类两性离子混合模式色谱固定相。将所合成的固定相用于生物大分子的分离,结果表明所三种固定相均对蛋白有很好的选择性,在pH=8.0时候,三种两性离子固定相均可以选择性的只保留碱性蛋白,通过改变流动相pH可以使得酸性蛋白也在此类固定相上保留,当pH=6.0时,半胱氨酸柱可以同时分离七种酸碱性蛋白;当pH=6.0时谷胱甘肽柱可以同时分离六种酸碱性蛋白。同ODS柱比较,本实验制备的两性离子固定相对碱性蛋白表现出更佳的选择性。同时蛋白质在该类固定相上的质量回收率均大于90%。另外本章还研究了流动相中的有机溶剂浓度、盐浓度以及pH值等因素对蛋白质保留的影响。结果表明,随着流动相中有机溶剂浓度的减少,蛋白保留整体呈现出增强的趋势,体现出反相模式的保留规律;随着流动相中盐浓度的增加,蛋白保留整体呈减小趋势,体现出离子交换模式色谱的保留规律;随着pH值变化,蛋白的保留由于受到静电力和疏水力等多种作用力的影响,出现了明显的波动和变化的差异,且两性离子固定相对蛋白的选择性受pH的影响较大。3.配基的疏水性与静电作用对两性离子混合模式固定相分离蛋白的影响分别以溴乙基、溴庚基和溴十八烷为季铵化试剂,对半胱氨酸改性混合模式色谱固定相上的伯氨进行季铵化改性,制备了三种季铵化改性半胱氨酸两性离子色谱固定相。测试了所合成的三种两性离子色谱固定相对标准蛋白质的分离效率,三种季铵化固定相均在pH=8.0的时候,表现出了对碱性蛋白的选择性保留,在低pH时可以实现对酸碱性蛋白的同时保留。通过改变流动相中的有机溶剂浓度、盐浓度和pH值,研究这些变量对溶质保留的影响,结合配基结构,疏水片段常数等参数,探究这类反相离子交换混合模式色谱固定相上疏水与静电作用是如何共同作用的。结果表明,通过调节固定相上疏水基团和静电作用基团的强弱,可以改变固定相的选择性,对这类具有离子交换作用的反相色谱固定相的合成具有一定的指导意义。利用计量置换保留模型,探讨了乙基季铵化半胱氨酸柱上蛋白的保留机理,分别在离子交换和反相色谱模式下对蛋白质的保留行为进行研究。在反相模式下,蛋白质的保留满足计量置换理论的第一组线性方程和第二组线性方程,说明固定相具有反相的性质,在离子交换模式下,蛋白质的保留只满足计量置换的第一组线性方程,说明固定相具有离子交换作用的性质。所得R值均大于0.99,表明利用计量置换理论来解释蛋白质在这类固定相上的混合保留机理是可信的。4.反相/离子交换液相色谱对鸡蛋清、猪心粗提液和牛奶中蛋白质的分离纯化将所合成的季铵化半胱氨酸柱用于实际样品蛋白的分离,在流动相pH=8.0时,分离了猪心中的细胞色素C,纯度为93.2%。在流动相pH=4.0时,分离了牛奶中的α-乳白蛋白,纯度为94.3%。利用了所合成固定相在特定的pH下能够选择性的只保留碱性蛋白的特点,用一根该色谱柱,仅通过改变流动相pH的方式,构建了离线二维色谱,并将其用于鸡蛋清中酸碱性蛋白的分离,首先在pH=8.0时成功分离了蛋清中抗生物素蛋白和溶菌酶两种碱性蛋白,纯度分别为93.5%和98.3%,然后改变流动相的pH,在PH=4.0时,分离了卵白蛋白,纯度为87.5%。结果表明所合成的固定相适用于蛋白质的分离,对于蛋白质组学样品的分析有着实际的应用价值。