随着基因组和后基因组时代的到来,核酸杂交技术广泛应用于单核苷酸多态性(SNP)的样本筛选,基因表达研究、医学诊断、食品和环境分析等领域。尤其是各种基于固相的核酸杂交技术因可方便地去除未杂交的DNA/RNA目标分子,有效降低非特异性吸附而具有高特异性和高灵敏度的检测性能,从而得到快速发展。与平面基质相比,磁性微球在溶液中均匀分散并且具有极大的拟液相特异性反应表面,因此可以提供更快的反应动力学,从而具有更为广泛的应用前景。在基于磁球的分子诊断技术中,最为关键的因素是固定化寡核苷酸探针与目标核酸分子的杂交效率,即杂交效率的高低是决定分子诊断技术性能优劣的关键。许多参数会影响目标DNA/RNA分子与固定在磁性微球表面上寡核苷酸探针的杂交效率,包括杂交环境、目标分子DNA/RNA的长度、寡核苷酸探针的长度、寡核苷酸探针的固定化密度和杂交位点与荧光分子标记之间的距离等。然而,大多数的研究是以固定在平板载体的寡核苷酸探针与目标分子的杂交效率为主,且是以解决特定的应用需求而对影响核酸固相杂交效率开展的部分因素探究,而很少有工作对具有表面曲率的磁球为载体的核酸固相杂交普适性影响规律进行系统探索的研究,因此本文着重于此开展研究,希望得到系统性、普适性的影响规律,为高效分子检测方法提供基础理论和数据分析的支撑。首先,本文以非小细胞肺癌EGFR基因21外显子L858R序列上的片段为杂交检测的模式目标核酸分子,采用共价偶联方法制备了寡核苷酸探针包被的磁性微球,并与Cy5荧光分子标记的目标分子DNA片段进行互补配对,构建基于磁球的核酸杂交体系,再采用流式荧光分析方法对基于磁球的核酸杂交性能进行检测与分析。其次探究了杂交环境,如杂交液的成分,寡核苷酸探针间隔臂的长度,杂交时间,杂交温度和目标分子的浓度对于基于磁球的核酸杂交效率的影响,得到了一系列影响因素下的最优结果。再次,为了更好地设计寡核苷酸探针,以便在核酸杂交反应中提供更高的杂交效率与特异性,探究了寡核苷酸探针的长度与固定密度对核酸杂交反应效率的影响。然后,探究了不同的目标分子长度与不同的杂交位点与荧光分子标记之间的距离对于核酸杂交效率的影响。结果表明,在研究的三种目标分子的长度分别为111-bp、210-216-bp、320-326-bp中,111-bp长度的目标分子DNA产生更高的荧光强度值,而且目标分子DNA 5’端修饰的Cy5荧光分子离磁性微球表面偶联的寡核苷酸探针位置越近时,产生的荧光强度值更高。最后,在所研究的最优杂交条件下,探究了基于磁球的核酸杂交反应的最低检测限,采用流式细胞仪的检测方法,结果表明,体系中平均每个磁球加入的目标分子的个数最少为208即可被检出。同时,为了阐明磁性微球表面寡核苷酸探针长度、密度等因素对杂交效率的影响机制,本文采用双倒数法成功建立了固定化探针与目标分子DNA结合常数的测试方法,并以建立的方法测试得到了不同探针状态与目标分子DNA的结合常数,对基于磁球表面固定化寡核苷酸探针的杂交机制给出了定量化的理论分析。综上,本文系统研究了基于微球表面固定的寡核苷酸捕获探针的设计以及目标分子的结构,不仅可以为核酸杂交技术中探针的设计和目标分子的选取提供指导以及理论基础,从而提高核酸杂交反应的效率以及对目的核酸分子的检测灵敏度,也可以为自动化的高通量分子检测平台提供检测方法学的策略,并能为制备应用于分子诊断的高性能生物载体提供理论与实验参考。