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目的探讨Wisp2基因敲除对小鼠肥胖表征的影响并探讨可能的调控机制,为肥胖治疗提出新的分子机制和实验依据。材料和方法本文使用Wisp2基因敲除小鼠作为研究对象,建立四组动物模型,分别是野生小鼠(WT)普通饮食组、WT高脂饮食组,和Wisp2基因敲除(Wisp2-/-)普通饮食组、Wisp2-/-高脂饮食组。监测四组小鼠的体重,待WT高脂饮食组小鼠达到肥胖指标(超过正常体重20%)时,将上述四组小鼠同时处死取材。1.新生小鼠基因型鉴定取小鼠尾尖组织,使用碧云天鼠尾基因型快速鉴定试剂盒(D7283M)提取小鼠的DNA,PCR反应后,进行琼脂糖凝胶电泳检测。2.Wisp2基因敲除效果鉴定Trizol法提取小鼠腹股沟处白色脂肪(iWAT)和附睾处白色脂肪(eWAT)的RNA,qPCR法检测Wisp2的m RNA相对表达量;提取iWAT中的蛋白,western blot检测Lac Z的表达;对iWAT进行冰冻切片,免疫组化观察Lac Z的表达。3.Wisp2基因敲除对小鼠肥胖表征的影响每周监测小鼠的体重;对收取的iWAT和eWAT组织样本称重分析;核磁共振法检测小鼠的体脂率。4.Wisp2基因敲除对脂代谢的影响用全自动生化分析仪测定小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇((low density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein,HDL)的含量;肝脏组织冰冻切片并进行油红O染色。5.Wisp2基因对脂肪分化的影响分别对iWAT和eWAT进行冰冻切片和石蜡切片,HE染色观察脂肪细胞形态;从WT及Wisp2-/-小鼠的iWAT中分离得到Wisp2+/+(正常对照)和Wisp2-/-的原代间充质干细胞;用无关序列(NC)慢病毒及过表达Wisp2慢病毒感染3T3L1细胞并通过抗生素筛选得到相应的慢病毒对照及过表达Wisp2的3T3L1细胞系;用Cell Titer-LumiTM发光法检测上述两组细胞的增殖,并用油红O染色观察脂肪细胞的分化。6.Wisp2基因敲除对饮食的影响每周监测小鼠的饮食量,用qPCR法检测下丘脑、iWAT和eWAT中黑皮质激素受体辅助蛋白2(Mrap2)的m RNA表达水平。结果我们首先用PCR的方法对新生小鼠进行基因型鉴定,接着应用Real-time qPCR的方法对筛选出来的Wisp2基因敲除小鼠进行了验证,结果显示无论给予普通饮食还是高脂饮食,基因敲除小鼠iWAT和eWAT中Wisp2 m RNA的表达量都几乎检测不到,western blot和免疫组化结果显示,Lac Z在WT小鼠中几乎不表达,而在Wisp2-/-小鼠中大量表达。高脂饮食五个月后,Wisp2-/-小鼠的体重增加明显低于WT小鼠(P<0.05),Wisp2-/-小鼠的iWAT与eWAT的比值显著高于WT小鼠(0.859±0.136 vs 0.722±0.138,P<0.05),同时体脂率明显低于WT小鼠(0.336±0.02 vs 0.381±0.009,P<0.01)。血脂检测结果显示高脂饮食后,Wisp2-/-小鼠与WT小鼠相比,TC含量有所降低但是没有统计学差异(2.643±0.702mmol/L vs 3.083±0.629 mmol/L,NS),LDL和HDL含量均明显降低(0.329±0.042mmol/L vs 0.415±0.112 mmol/L,P<0.05;1.702±0.523 mmol/L vs 2.11±0.248mmol/L,P<0.05);油红O染色提示高脂饮食使WT小鼠肝脏中脂滴大量增多,Wisp2-/-小鼠肝脏中的脂质沉积明显低于WT小鼠。我们对小鼠iWAT和eWAT的冰冻切片和石蜡切片进行了HE染色,发现在普通饮食条件下,无论是在iWAT还是在eWAT,Wisp2-/-小鼠的脂肪细胞形态都明显小于WT小鼠(68.8±2.168 vs35.2±1.924个细胞/视野(200X),P<0.05;34±1.581 vs 18±1个细胞/视野(200X),P<0.05),高脂饮食后,细胞变大,但组内比较无差异(14.4±1.817 vs 24.4±1.14个细胞/视野(200X),11±2.345 vs 16.8±1.643个细胞/视野(200X),NS);Wisp2基因敲除抑制了脂肪间充质干细胞的增殖和分化,过表达Wisp2促进了脂肪前体细胞的增殖和分化。最后,我们观察了小鼠的进食情况,结果显示普通饮食条件下,WT小鼠和Wisp2-/-小鼠相比,每周能量摄入没有显著差异,而在高脂饮食条件下,WT小鼠的每周能量摄入明显高于Wisp2-/-小鼠(109.957±6.714 kcal vs105.172±6.765 kcal,P<0.05);HFD饮食后,Wisp2-/-小鼠iWAT、eWAT和下丘脑中Mrap2的表达量均显著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。结论1.Wisp2基因敲除抑制高脂饮食诱导的小鼠体重的增加,上调iWAT/eWAT比值,显著降低体脂率。2.Wisp2基因敲除能够降低高脂饮食小鼠的TC和LDL含量。3.Wisp2基因敲除能够降低高脂饮食小鼠肝脏中脂质的沉积。4.Wisp2基因敲除使普通饮食条件下小鼠iWAT和eWAT细胞变小。5.Wisp2基因敲除抑制了脂肪前体细胞的增殖和分化。6.Wisp2基因敲除降低了高脂饮食条件下小鼠的摄食量,并且上调了小鼠iWAT、eWAT和下丘脑中Mrap2的表达量。