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目的:冠心病(coronary heart disease,CHD)是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)导致器官病变的最常见类型之一。AS是一种慢性炎症性疾病,CD4+CD25+FOXP3+调节性T(regulatory T,Treg)细胞在其中发挥关键的抗AS保护作用。然而,Treg细胞在AS疾病发展中出现数量减少和功能受损,且潜在机制尚不清楚。内皮细胞标记物CD31又名血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1),是一种跨膜嗜同种并含有两个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine inhibitory motifs,ITIMs)的抑制性受体。已发现CD31在T细胞应答中发挥重要作用且有助于维持T细胞耐受,其免疫调节作用也已在AS中有所涉及。此外,还发现促进CD31表达有助于提高体内Treg细胞比例,而CD31缺失则引起体内Treg细胞抑制能力降低,提示CD31表达与Treg细胞功能间存在关联。叉头转录因子FOXP3(forkhead box protein 3)是Treg细胞的特异性分子标记,该分子对此类细胞的发育和功能是至关重要的。在本研究中,我们调查了Treg细胞中的CD31+亚群的数量和功能质量在生理(健康人群)或病理状态(CHD患者)下的变化及其与FOXP3的相关性,以发现CD31是否可能通过影响FOXP3表达而调控Treg细胞功能并加强其抗AS作用。方法:(1)来自上海交通大学医学院附属新华医院的71例CHD患者纳入本研究。CHD患者还进一步分为稳定型心绞痛组(stable angina pectoris,SAP)34例和急性冠脉综合征组(acute coronary syndrome,ACS)37例。为了说明各组别之间的可比性,我们首先分析了疾病组和健康对照组(healthy controls,HC)的临床资料。(2)Ficoll密度梯度离心法分离出新鲜的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。采用多色流式细胞仪分析检测HC组,SAP组和ACS组PBMCs来源的total-Tr(CD4+CD25+CD127ˉ)、CD31+Tr(CD4+CD25+CD127-CD31+)和CD31-Tr(CD4+CD25+CD127-CD31-)三群细胞比例及不同细胞亚群中FOXP3的表达水平。(3)采用人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒结合荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)的方法,分选出健康捐献者PBMCs来源的不同Treg亚群细胞total-Tr(CD4+CD25+FOXP3+)、CD31+Tr(CD4+CD25+FOXP3+CD31+)和CD31-Tr(CD4+CD25+FOXP3+CD31-)。流式细胞术检测用于三组细胞体外活化前后的表型鉴定。细胞形态学观察与CFSE染色细胞增殖实验用于评估细胞增殖情况。混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)用于评估Treg细胞的免疫抑制功能。(4)通过胞内细胞因子流式细胞分析法,检测分析CHD患者或HC组来源的CD31+Tr或CD31-Tr细胞给予或不给于细胞刺激后,其内TGF-β1、IL-10与IL-2的分泌水平。(5)通过胞内蛋白磷酸化流式细胞分析法,检测分析CHD患者或HC组来源的CD31+Tr或CD31-Tr细胞给予或不给于细胞刺激后,其内SHP2、STAT5和STAT3的磷酸化水平变化。(6)以P<0.05为差异有统计学意义。研究中所有统计分析均采用Graph Pad Prism软件(版本5.0)。结果:(1)不同人群临床资料分析提示,ACS组中有助于反映疾病严重程度的生化指标,如Hs-CRP,Tn I和NT-pro BNP,均高于SAP和HC组。其他临床资料在HC、SAP和ACS组间比较未见明显统计学差异。HC和CHD组间所有临床资料比较均未见显著统计学差异。(2)与健康人相比,CHD患者体内CD31+Tr细胞比例下降且其胞内FOXP3表达水平明显下降。健康人中CD31+Tr细胞内FOXP3表达水平高于CD31-Tr细胞。相关性分析表明,无论是在健康人还是CHD患者中,total-Tr细胞内CD31与FOXP3表达均存在正相关性。(3)Total-Tr细胞体外活化培养7天,FOXP3表达可稳定维持5天,但在第7天出现下降。因此将Treg细胞体外活化培养的时间点定为5天,以确保Treg细胞表型在培养过程中无明显改变。已证实CD31+Tr细胞体外活化培养5天能稳定表达FOXP3而相同条件下CD31-Tr细胞内FOXP3表达水平出现明显下降。(4)体外细胞功能实验表明,与CD31-Tr细胞相比,CD31+Tr细胞的增殖能力和免疫抑制能力明显增强。(5)我们比较了CHD患者和健康人来源的CD31+Tr和CD31-Tr细胞分泌TGF-β1、IL-10和IL-2的情况。结果显示健康人体内CD31+Tr细胞分泌上述三种细胞因子的能力强于CD31-Tr;而CHD患者体内CD31+Tr细胞分泌这三种细胞因子的能力较健康人下降。(6)胞内蛋白磷酸化流式分析表明,无论健康人还是CHD患者体内CD31+Tr细胞中SHP2磷酸化水平均明显高于CD31-Tr细胞;而CHD患者体内CD31+Tr细胞中SHP2磷酸化水平较健康人出现明显下降。我们还发现健康人体内CD31+Tr细胞中STAT5磷酸化水平高于或相当于CD31-Tr细胞;而CHD患者体内CD31+Tr与CD31-Tr细胞中STAT5磷酸化水平均较健康人明显下降且在CD31+Tr细胞中STAT5磷酸化水平下降幅度更大。然而,检测发现无论健康人还是CHD患者体内CD31+Tr细胞中的STAT3磷酸化水平与CD31-Tr细胞相比均无明显统计学差异,且健康人与CHD患者组间比较也无明显统计学差异。结论:CD31+Tr细胞亚群比例下降和功能受损以及与之相关的FOXP3表达下降可能是导致CHD中Treg细胞功能障碍的原因之一。此外,CHD中CD31+Tr细胞内FOXP3表达下降可能与SHP2(CD31活化相关分子)和STAT5(FOXP3转录相关分子)磷酸化水平降低有关,推测CD31活化受损引起SHP2与STAT5磷酸化水平降低进而导致FOXP3表达减少是CHD患者体内CD31+Tr细胞功能下降的分子机制之一。我们的研究结果提示,促进Treg细胞中CD31的表达与活化将可能有助于恢复或提高Treg细胞免疫调节能力并加强其抗AS作用。