研究背景:我国慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的患病率高达10.8%,但知晓率仅为12.5%,且发病率和死亡率居高不下。CKD主要临床表现为肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)显著下降、尿蛋白逐渐增加,而且经常伴随有肠道、心血管、内分泌等多系统的并发症。其中,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是CKD最常见的并发症和首位(超过50%)死亡原因,而肠道功能紊乱也是CKD的常见并发症,临床表现为食欲减退、恶心、呕吐、腹泻、便秘,晚期患者肠黏膜糜烂、溃疡、出血,患者常常以肠道功能紊乱为首发症状。反过来,肠道功能紊乱又会促进尿毒症毒素的生成,进一步加重肾损伤及其并发症,尤其是CVD。高达30%的CKD患者并发心衰,而40-50%的心衰病人合并有慢性肾功能不全。所以肾脏、肠道、心脏作为一个整体而相互影响,鉴于三者之间存在如此密切的联系,近期有研究人员将三者合称为“肾-肠-心”轴,其功能紊乱将形成恶性循环,最终导致CKD及其并发症的进展。因此探索CKD合并肠、心功能紊乱的发病机制及其防治策略具有重要的临床意义。值得注意的是,传统的CVD、肠功能紊乱危险因素虽然在CKD患者中也普遍存在,但是难以解释此类人群如此之高的CVD和肠功能紊乱发病率。故我们课题组将研究聚焦于蓄积在患者体内的“肾特异性”危险因素,即尿毒症毒素,对CVD和肠功能紊乱的影响。目前已有部分研究(包括本课题组的研究)初步证实尿毒症毒素参与了CKD进展、肠屏障损伤和心血管事件。其中,终末期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPPs)通过调节氧化应激而损伤肠上皮细胞;而一项体外研究发现尿素也能损伤肠黏膜屏障。此外,水溶性小分子物质的蓄积,例如高磷酸盐(high phosphate,HP)、纤维母细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)和氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide,TMAO)逐渐成为CKD的重要特征,同时也是CKD患者并发CVD的危险因素。中分子毒素的升高,例如β2微球蛋白(β2-microglobulin,B2M)能预测冠状动脉疾病的严重程度。蛋白结合毒素,例如硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)与CKD进展、心血管事件增加密切相关。然而,尿毒症毒素在“肾-肠-心”轴中的独特作用和分子机制迄今尚未完全阐明。尽管已有实验初步探索了尿毒症毒素对肠黏膜屏障的损伤效应,但是尿毒症毒素与肠道菌群的相互作用及其作用机制还远未解释清楚。尤其是考虑到肠道菌群与肠功能紊乱的密切关系,那些经由肠道菌群代谢产生、又可能反过来损伤肠道、而且常规透析难以清除的蛋白结合毒素,在CKD并发肠功能紊乱中的作用更值得重点关注。本研究前期以CKD小鼠肠道、心脏为研究对象,经肠道菌群16s核糖体RNA测序、心脏组织芯片分析,初步筛选到尿毒症毒素IS、HP可能参与CKD“肾-肠-心”轴功能紊乱,因此拟针对IS、HP的作用及机制作深入探究。本课题前期研究筛选到干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IRF1)可能参与CKD及其并发症的进展。据报道,IRF1是重要的IRF家族成员,也是一个经典的转录因子,它的N、C末端分别含有高度保守的DNA结合域和转录抑制域,使其能直接结合于靶基因启动子区的IRF应答元件,从而抑制靶基因转录。IRF1参与了众多生物学过程,包括免疫、炎症和肿瘤的发生发展。近期研究发现,在小鼠主动脉缩窄术制备的左心室肥厚模型中,心肌特异性过表达IRF1能显著加重小鼠的心肌肥厚,而敲除IRF1基因则能缓解上述症状。已知在生理状态下,IRF1在肾脏、肠道、心脏组织中的表达较低;但是在CKD并发肠、心功能紊乱的病理条件下,IRF1的表达及其功能尚未见文献报道。研究目的:阐明尿毒症毒素和转录因子IRF1在CKD并发肠、心功能紊乱中的重要作用及其分子机制,并初步探讨干预策略。研究方法:(1)现象观察构建5/6肾毁损CKD小鼠模型,利用HE染色、透射电镜、肠黏膜通透性(FITC-dextran)、qPCR(检测紧密连接相关基因表达)实验,评估肠黏膜屏障损伤情况。并利用16s r RNA肠道菌群测序、HPLC、跨上皮电阻、肠通透性和透射电镜,筛选出尿毒症毒素IS对肠黏膜屏障的损伤效应。利用超声心动图、HE染色、WGA染色、qPCR(检测肥大基因表达),分析CKD小鼠心肌肥大和心衰的情况。收集CKD小鼠心脏组织,利用芯片分析、透射电镜、q PCR和Western blot实验,筛选出调控线粒体能量代谢的关键基因。利用qPCR、Western blot、Seahorse氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)、线粒体膜电位、ATP水平检测等实验,筛选和验证HP在诱导心肌能量代谢重塑中的作用。(2)机制探索用IS处理肠上皮细胞和小鼠,利用q PCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术等实验,检测线粒体自噬在肠黏膜屏障损伤中的作用;并经进一步生物信息学分析和实验验证,探讨IRF1和动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)在其中的作用。用HP处理心肌细胞和小鼠,明确HP对IRF1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活蛋白(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGC1α)表达的调控作用。利用si RNA基因敲低和重组质粒过表达实验,检测IRF1在线粒体自噬、肠屏障损伤,以及能量代谢重塑、心衰中的作用。借助生物信息学分析、构建基因启动子区截短的重组质粒、双荧光素酶报告基因、点突变和Ch IP等实验,阐明转录因子IRF1对DRP1、PGC1α基因转录的调控作用。(3)效应干预和临床验证给予IS清除剂AST-120、IRF1基因敲除小鼠,评估对IS诱导肠屏障损伤的干预效果。收集临床CKD患者和健康志愿者的肠镜、血液标本,检测血清IS水平及肠组织中IRF1-DRP1信号通路、线粒体自噬和肠黏膜屏障的变化。利用PGC1α诱导剂和IRF1基因敲除小鼠,检测对HP上述效应的逆转作用。利用以高磷血症为特征的Klotho基因突变小鼠(kl/kl)验证IRF1-PGC1α信号通路在心肌能量代谢重塑和心衰中的作用。最后,收集213例CKD患者的临床病例资料,分析HP与心肌肥大和心衰的关系。研究结果:1.CKD小鼠肠黏膜屏障破坏的现象观察。与对照组小鼠相比,经FITC-Dextran灌胃发现CKD小鼠肠道通透性显著升高,而且CKD小鼠肠道组织HE染色可见肠黏膜损伤,透射电镜观察到紧密连接破坏,qPCR检测提示紧密连接相关基因表达降低。取对照组和CKD组小鼠粪便行16s核糖体RNA测序提示肠道菌群紊乱,热图分析证实:CKD小鼠肠道大肠杆菌显著升高,而乳酸杆菌显著降低。但是跨上皮电阻、qPCR实验发现:菌群代谢的吲哚衍生物IS,而非吲哚,损伤了肠上皮细胞;腹腔注射100mg/kg IS能促进肠道通透性、破坏紧密连接、诱导肠黏膜损伤。2.IS通过促进IRF1直接结合于DRP1基因启动子区而抑制DRP1表达及其介导的线粒体自噬,进而诱导肠上皮细胞损伤的机制探讨。2.1用IS处理肠上皮细胞和小鼠,发现IS能促进促进活性氧(reactive oxidative species,ROS)、抑制ATP水平,并诱导线粒体膜电位丢失。转染GFP-LC3、mCherryGFP-LC3质粒,分别给予自噬诱导剂和抑制剂,发现IS能抑制线粒体自噬流,而透射电镜也观察到线粒体自噬小体的蓄积。2.2接下来的机制探讨发现:IS并未影响经典的mTOR信号通路,而是显著抑制线粒体分裂相关蛋白DRP1表达。我们构建了DRP1过表达质粒,发现其能显著逆转IS介导的线粒体自噬障碍和肠上皮细胞紧密连接损伤。2.3进一步生的物信息学分析和q PCR验证发现DRP1启动子区有2个潜在的转录因子(IRF1和阴阳1,Yin-Yang1,YY1)受IS调控。利用siRNA敲低基因表达后发现:敲低IRF1,而非YY1,能逆转IS对DRP1的调控作用。并且敲低IRF1表达后,能显著缓解IS介导的ROS生成增多、线粒体自噬障碍、TER和紧密连接相关基因表达降低。2.4结合生物信息学分析,我们构建了DRP1基因启动子区截短的重组质粒,双荧光素酶报告基因、点突变和ChIP实验证实:转录因子IRF1能直接结合于DRP1基因启动子区(-508～-497,CACAGTGAAACC)而调控其转录。3.CKD小鼠喂食AST-120或给予IRF1基因敲除小鼠注射IS,均发现:小鼠肠组织损伤减轻,具体表现为:肠组织损伤评分和肠道通透性均显著降低,紧密连接更加致密、紧密连接相关基因表达升高;而且肠道组织中升高的IRF1和降低的DRP1表达均有所恢复,蓄积的线粒体自噬小体也显著减少。最后,HPLC检测发现CKD患者血清IS水平较高,而肠镜所取的组织标本中IRF1表达升高、DRP1表达降低、线粒体自噬障碍、肠黏膜屏障破坏。4.HP诱导CKD小鼠发生心肌能量代谢重塑、心肌肥厚和心衰的现象观察。4.1透射电镜观察到CKD小鼠心脏组织中,线粒体排列紊乱、肿胀、空泡化、嵴断裂;同时,芯片分析、qPCR和Western blot实验提示:显著下调的基因主要集中于线粒体;CKD小鼠心脏发生能量代谢重塑,即脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHO)相关基因表达降低、糖酵解相关基因代偿性升高;调控线粒体生物合成和能量代谢的关键基因PGC1α表达降低。4.2鉴于CVD与CKD固有的危险因素密切相关,我们筛选了一系列尿毒症毒素,发现HP能显著抑制PGC1α表达。用HP处理心肌细胞,发现:细胞OCR、ATP水平、FAO和OXPHO基因表达均显著降低,而糖酵解基因升高;ROS生成增加、线粒体DNA拷贝数减少、线粒体膜电位丢失。4.3给予CKD小鼠高磷喂食(high phosphate diet,HPD)12周后,心肌肥厚和心衰更为严重,PGC1α及其靶基因表达的降低也更加明显,而且线粒体形态改变、ATP水平降低、FAO和OXPHO相关基因降低均更为显著。临床病例资料也提示HP与心肌肥厚和心衰呈正相关。5.HP通过组蛋白H3K9乙酰化而上调IRF1基因表达,IRF1通过直接结合于PGC1α基因启动子区而抑制其转录,进而诱导线粒体能量代谢障碍和心肌重构的机制探讨。5.1转染PGC1α过表达质粒或给予PGC1α的关键效应剂Nam均能显著缓解HP诱导的PGC1α低表达、ROS生成增多、代谢基因表达紊乱、ATP水平降低和心肌细胞肥大。与体外实验一致的是:腹腔注射Nam(400 mg/kg/天)显著减轻了高磷饮食CKD小鼠的心肌肥厚、心衰和能量代谢重塑。5.2生物信息学预测、q PCR和Western blot实验从体内外验证,发现IRF1是经HP处理后唯一升高的转录因子。我们设计了2对针对IRF1的siRNA,发现二者均能缓解HP介导的PGC1α表达下调、ROS生成增多、ATP水平降低、代谢基因表达改变和心肌肥大。IRF1过表达质粒转染的细胞中,可见PGC1α表达降低;而siRNA干扰IRF1表达后,PGC1α表达也随之升高。5.3接下来,我们利用基因转录抑制剂放线菌素D、蛋白翻译抑制剂放线菌酮、蛋白酶抑制剂MG132、溶酶体酶抑制剂氯喹处理细胞后,并不能阻止HP对PGC1αm RNA或蛋白的抑制作用,提示HP抑制PGC1α表达并非通过调控其m RNA稳定性或蛋白降解途径。结合生物信息学分析,我们构建了6个PGC1α基因启动子区截短质粒,经双荧光素酶报告基因、点突变和ChIP实验证实:IRF1能直接结合于PGC1α启动子区(-632～-612,TCCTTCTTTCTTTTCCCTATT)。5.4为探索HP如何进入心肌细胞,我们筛选了磷酸盐转运蛋白,发现HP能显著上调Pit1和Pit2的表达,而利用siRNA同时敲低二者的表达能显著缓解HP诱导的IRF1上调、PGC1α下调和心肌肥大。5.5最后,Ch IP实验证实:HP处理后,IRF1启动子区有更多乙酰化的H3K9结合,而组蛋白乙酰转移酶抑制剂则能减轻HP介导的IRF1表达上调。6.多种动物模型验证和效应干预。以高磷血症为经典特征的kl/kl小鼠和腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中,同样出现心肌肥厚和心衰,并伴随有IRF1高表达、PGC1α低表达、线粒体功能紊乱以及能量代谢重塑。小鼠敲低IRF1基因后,能显著缓解HP诱导的心肌肥厚、心衰和能量代谢重塑的效应。这不仅证实了IRF1在HP诱导心衰中的独特作用,而且还鉴定了IRF1有望成为CKD并发CVD的潜在治疗靶点。结论:综上所述,本研究证实尿毒症毒素是诱导CKD并发肠、心功能紊乱的关键因素,而转录因子IRF1则是其中的重要环节。机制上,蛋白结合毒素IS通过促进IRF1直接结合于DRP1基因启动子区而抑制DRP1表达及其介导的线粒体自噬,进而诱导肠黏膜屏障损伤。HP通过组蛋白H3K9乙酰化上调IRF1基因表达,IRF1通过直接结合于PGC1α基因启动子区而抑制其转录,最终导致心肌能量代谢重塑和心衰。本文从“肾-肠-心”轴内在关联的角度,明确了CKD并发肠道、心脏功能紊乱的临床现象,探讨了尿毒症毒素IS、HP的作用机制,阐明了转录因子IRF1及其靶基因DRP1、PGC1α在其中的重要作用。本课题有望为临床探索CKD患者并发肠、心功能紊乱的发病机制及其防治策略提供新的理论依据。