研究背景肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma,ACC)是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤。ACC占恶性肿瘤的0.02%。ACC恶性程度高,侵袭性强。早期临床诊断困难,约有30%～85%的ACC患者诊断时已有远处转移,其中大部分生存时间不超过1年。发病率低,年发病率为1-2/100万人。因此临床上观察其发生发展过程非常困难,也很难获得新鲜的、不同时期的ACC组织标本。近年来虽然从组织水平、细胞水平和基因水平上对肾上腺皮质癌的生物学指标进行了大量的研究,但到目前为止,还没有发现特异性及敏感性较好、具有临床应用价值的指标。克隆研究显示基因改变在肾上腺皮质肿瘤发生中具有重要作用,已发现不同位点或染色体区域及基因与ACC的发生有关。ACC的分子机理未明,可能与抑癌基因的失活(TP53、Men-1、P57Kip2、H19)、原癌基因(Gas、Ras、ACTH受体缺失)以及生长因子IGF-2的过度表达有关。因此进一步研究其发病的分子机制,发现更为有效的分子水平诊断、治疗靶点,对肾上腺皮质癌的诊断、治疗及预后显得尤为重要。microRNA(miRNA)是一类由19～25个核苷酸组成的非编码小分子单链RNA,广泛存在于植物、线虫及人类的细胞中。第一个miRNA (Lin-4)是在研究线虫发育的遗传筛选中发现的,它能通过与Lin-14mRNA的3’UTR的部分互补结合来抑制其蛋白的翻译。miRNA真正进入研究人员视野的是第二个miRNA(Let-7)被发现,Let-7除了可以抑制靶基因的表达,更重要是Let-7在不同物种之间为高度保守。RNA-polⅡ将miRNA的编码基因转录为pri-microRNAs, pri-microRNAs进一步自我折叠成一个约60-80nt的发夹状茎环结构；在细胞核内,此发夹结构又被microprocessor复合体识别和剪切,形成pre-microRNAs。RNase核酸酶Drosha在microprocessor复合体中起剪切作用,其辅助因子为DGCR8蛋白。细胞核中的pre-microRNAs在受体蛋白Exportin-5和Ran-GTP的协同作用下转运到细胞质中,然后在Dicer酶和其辅因子TRBP共同作用下释放成熟的miRNA.近年来在许多生物中发现了上千种miRNA,均在生物体内基因调控网络中起重要作用。miRNA在ACC中的作用也正受到人们的关注,目前研究发现多种miRNA在肾上腺皮质癌中异常表达,且在肾上腺皮质癌的发生、发展及预后中充当着重要的角色。Ozata等人采用采用微阵列分析及qRT-PCR技术研究发现miR-483-3p、miR-483-5p、miR-210及miR-21在肾上腺皮质癌组织中较肾上腺腺瘤及正常组织中呈高表达,而miR-195、miR-497、miR-1974在肾上腺皮质癌组织中较腺瘤或正常组织低表达。进一步细胞实验研究发现,在NCL-H295R人肾上腺皮质癌细胞中,抑制miR-483-3p及niR-483-5p的表达或增加miR-195及miR-497表达可抑制肿瘤细胞的增殖,抑制miR-483-3p同时增加miR-195及miR-497表达则可导致肿瘤细胞的死亡。我们前期通过实时荧光定量PCR技术及免疫荧光技术对比研究发现,肾上腺皮质癌miR-205表达较正常肾上腺组织miR-205低,提示miR-205表达肾上腺皮质癌的发生、发展呈负相关,miR-205可能起抑制肿瘤生长的作用。在137例ACC患者多因素Cox风险模型表明：PCAF与ACC预后相关,进一步预测分析发现,miR-205和PCAF基因mRNA3’ UTR碱基(含3351C/T)为互补配对,但它们在ACC中的具体关系,还未见有报道。而E2F1、VEGF-A及E-cadherin在其他肿瘤中已经被证实是miR-205的靶基因,但它们肾上腺皮质癌中的关系还未见报道。目的验证miR-205在肾上腺皮质癌中是否起抑癌作用及探讨其初步作用机制。方法1真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205构建与鉴定：依据miRbase数据库中pre-miR-205序列设计引物,PCR扩增pre-miR-205基因并将其克隆至线性化的pcDNA3.1(+)质粒中,获得重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205,经双酶切及测序分析后,将其及对照空载体转染肾上腺皮质癌SW-13细胞,采用实时荧光定量RCR法鉴定miR-205在SW-13细胞中表达。2SW-13细胞转染pcDNA3.1(+)-miR-205与稳定细胞株的筛选：2.1细胞培养：人肾上腺皮质癌细胞SW-13购自中国科学院上海生命科学研究所,胎牛血清(Hyclone, Cat.No.SH30087.01), Leibovitz L-15培养基(Hyclone, Cat.No. SH30525.01), PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone, Cat.No. SH30256.01B),0.25%胰酶(Hyclone, Cat.No.SH30042.01)。培养条件为：37℃,无CO2培养。2.2杀伤浓度确定把SW-13细胞铺于96孔板,每孔约103个细胞,细胞贴壁良好时,加不同浓度的G418于细胞上,0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml,每个浓度6个平行孔。边缘孔不使用。观察一周,中间换一次液。1周后0-100ug/m1的G418浓度细胞有不同孔数细胞存活,200-1000ug/ml的G418浓度的细胞死亡。2.3质粒转染2.3.1转染前一天对细胞株进行传代,使其汇合度为60%-70%,转染采用Lipofectamine2000(invtrigen, Cat.No.11668019)转染试剂,转染时使用Opti-MEM (invtrigen, Cat. No.31985070)培养基。2.3.2转染使用24孔板,每孔加入lug质粒,稀释到400ul Opti-MEM培养基为A液,取2ul Lipofectamine2000溶解于100ul Opti-MEM培养基为B液,B液混合5分钟后,A液和B液混合,静止20分钟后加到细胞培养板中。以上操作是每孔用量。2.3.3孵育4小时后换为细胞生长培养基。2.4稳定筛选2.4.1转染后第二天,细胞培养基更换为含200ug/mlG418的完全培养基,筛选两周,期间死亡细胞较多时,以PBS清洗死亡的细胞,并且适时更换新的培养基。2.4.2两周后在倒置显微镜下观察,有成团细胞存活,用记号笔标记细胞团,用0.25%胰酶消化画圈的细胞群,每一团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养。2.4.3继续用200ug/ml的G418压力筛选两到三周。2.4.4再在倒置显微镜下观察,挑选出正常生长细胞群传代,筛选至细胞在200ug/ml的G418压力下没有明显死亡为止,此时收集1×106细胞,作qPCR检测。2.5RT-qPCR验证SW-13转染pcDNA3.1(+)-miR-205细胞的表达情况转染pcDNA3.1(+)-miR-205细胞组、转染pcDNA3.1(+)细胞组及未转染组分别进行培养,提取总RNA,纯度检测：OD260/OD280的比值大于1.8,在反转录酶作用下反转录形成得第一链cDNA为模板,由实时定量荧光miRNA特异引物进行PCR反应,使用SYBR Green PCR Master Mix,反应条件：95℃变性15s,65℃退火15s,72℃荧光检测32s,重复40个循环。60-95℃绘制溶解曲线,每个样品重复3次。PCR反应以U6为内参照,其引物为：U6-F:5’-CTCGCTT CGGC AGCACA-3’,U6-R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’; miR-205引物序列为：pre-miR-205F:5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCCACCGGAG-3’, pre-miR-205R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。3动物模型的建立实验分为三组：①转染pcDNA3.1(+)-miR-205重组质粒组(SW-13/miR-205);②转染pcDNA3.1(+)空载体组(SW-13/empty);③未转染组(SW-13).3周龄BALB/C雌性裸鼠由广东省人民医院实验动物中心提供,饲养环境为：无特异性病原(specific pathogen free, SPF)的超净层流架上,恒温(22℃～26℃)、恒湿(40%～50%),在无菌操作条件下由专业的饲养人员定期更换垫料、笼具、饲料和饮用水等。选取同一批次3周龄裸鼠18只,体重18-24g,随机分为三组,每组6只,分别将体外培养的人肾上腺皮质腺癌细胞(SW-13)、转染pcDNA3.1(+)-miR-205重组质粒人肾上腺皮质腺癌细胞株(SW-13/miR-205)、转染空载体的人肾上腺皮质腺癌细胞株(SW-13/empty),注射至其腋窝皮下,建立人肾上腺皮质腺癌移植瘤模型,隔日动态观察裸鼠生长状况、肿瘤生长情况,观察6周,6周后全部处死取材。根据每组肿瘤生长情况及大小绘制各组肿瘤生长曲线进行比较。4免疫组化4.1材料与方法：6周后,将裸鼠处死,将肿瘤组织取下,在广州军区广州总医院病理科进行常规石蜡包埋,切片,免疫组织化学均采用envision法常规脱蜡水化后,置于0.01mol/L枸橼酸缓冲液中经高压修复3分钟,室温下冷却,余步骤按说明书进行,DAB显色,苏木素复染,盐酸酒精分化。以抗体稀释液代替一抗作为空白对照。PCAF(E-8)、VEGF-A、E2F1(?)E-cadherin单克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司,Envision免疫组化检测试剂(GK500705)购于Dako公司。4.2结果判断：细胞浆出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性,采用半定量积分法对染色结果进行评估：每例随机选取10个高倍视野进行计数,按阳性细胞数占所有细胞数的百分比来进行判定：0-5%计0分；6%-25%计1分；26%-50%计2分；51%-75%计3分；76%-100%计4分；阳性表达强度：无染色计0分,浅黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。两种积分相乘,积分为0分,定为阴性(-)；积分为1-4分,定为弱阳性(+)；积分为5-8分,定为中度阳性(++)；积分为9-12分,定为强阳性(+++)。若两者判定结果相差达3分及以上,则重新判定。5实时荧光定量PCR检测PCAF、VEGF-A、E2F1及E-cadherin的表达水平将肿瘤从裸鼠体内取出,按Tritol一步法提取肿瘤组织的总RNA,异丙醇法对RNA进行浓缩,分光光度计测所提取的总RNA的纯度,甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的质量。取出60ng总RNA,用miRNA Isolasion Kit分离分子量小于100nt的小分子RNA,应用SuperscriptⅢ Reverse Trandcriptase Kit法进行逆转录合成cDNA,再应用Mx3005P型定量PCR仪来进行定量PCR检测。PCR条件：预变性95℃,2min,两步法95℃,15s,60℃,1min,40个循环。采用P-actin作为内参,进行归一化。通过MxProv4软件进行数据分析。样品目的基因的相对表达率(relative expression, RQ采用△△CT方法计算,RQ=2△△CT(CT表示反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数,ΔCT sample=CT sample-CTβ-actin sample ΔCT control=CT control-CTβ-actin control, ΔΔCT=ΔCT sample-ΔCT control)。结果1酶切和测序结果均证实pcDNA3.1(+)-205重组质粒构建成功。pcDNA3.1(+)转染组与未转染组相比,两者miR-205的表达无明显差异,而pcDNA3.1(+)-miR-205转染组与pcDNA3.1(+)转染组相比,pcDNA3.1(+)-miR-205转染组miR-205的表达升高约63.2倍(P<0.05),表明重组表达载体pcDNA3.1(+)-miR-205能够在SW-13细胞中高水平表达miR-205。2上调miR-205表达组较其他两组肿瘤体积明显缩小、重量明显减轻,其差异具有统计学意义(P<0.05)。3pcDNA3.1(+)-miR-205转染组肿瘤组织中PCAF、VEGF-A及E2F1的表达水平较其他两组明显减少(P<0.05), E-cadherin的表达水平较其他两组明显增高(P<0.05)。结论1miR-205在肾上腺皮质癌中发挥抑癌基因的作用。2肾上腺皮质癌组织中PCAF、VEGF-A及E2F1的表达水平与miR-205表达水平呈负相关,E-cadherin的表达水平与miR-205表达呈正相关,miR-205可能通过靶向PCAF、VEGF-A、E2F1及E-cadherin来发挥抑癌作用。