第一部分早年母婴分离应激对成年雌雄SD大鼠行为学影响以及对CUMS应激后应激反应性的影响目的:早年社会生活环境因素对于个体的发展至关重要。不同程度的母婴分离经历可能对大鼠的行为以及应激反应性具有不同影响,并且不同性别之间也可能存在差异性。本研究主要比较不同程度的早年分离应激对成年雌雄大鼠行为学影响;以及不同程度的早年分离应激对雌雄大鼠成年应激后应激反应性的影响。方法:出生后第四天（postnatal day,PND4）开始一直到PND11将新生鼠与母鼠进行持续一周的母婴分离（maternal separation,MS）应激,共分为三组,未分离组（no separation group,NS）,母婴分离15min组（maternal separation 15min group,MS15）以及母婴分离360min组（MS360）。PND21天进行断奶,并按性别进行分笼饲养。PND56天测量大鼠体重,并对一部分雌雄大鼠进行行为学检测[MS15（M,n=8;F,n=8）;MS360（M,n=8;F,n=8）;NS（M,n=8;F,n=8）],包括强迫游泳检测（forced swimming test,FST）、糖水偏好测验（sucrose preference test,SPT）以及旷场测验（open field test,OFT）。另一部分子鼠从PND56天开始给予连续四周的慢性不可预计性应激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）,分组包括NSNC组（no separation no CUMS,未经历MS亦未经历CUMS）、CUMS组（未经历MS但经历CUMS）、MS15+CUMS组,MS360+CUMS组,应激结束后PND84测量体重,并给予行为学检测,[NSNC（M,n=8;F,n=8）;CUMS（M,n=8;F,n=8）;MS15+CUMS（M,n=10;F,n=10）;MS360+CUMS（M,n=10;F,n=10）]。检测结束后对结果进行统计分析,比较不同应激状态下大鼠的行为学差异,以及不同性别对大鼠行为学影响。结果:（1）PND56天体重及行为学比较PND56天大鼠体重比较,两因素方差分析[性别（F,M）与早年应激状态（NS,MS15,MS360）]结果显示,性别对体重具有影响（P<0.01）,而不是MS应激状态对大鼠的体重产生影响（P>0.05）,且两者之间没有交互作用（P>0.05）。在PND56天雄性大鼠的平均体重明显高于雌性大鼠的平均体重。PND56天行为学比较,SPT指数比较结果显示性别及应激状态均对结果无明显影响。FST不动时间比较,发现性别对不动时间无影响,而应激状态对不动时间具有影响,雄性和雌性大鼠的MS360组不动时间均明显高于MS15组及NS组（P<0.01）,而NS组与MS15组无明显统计学差异。OFT指标比较,性别主效应及交互作用均不显著（P>0.05）,而应激状态的主效应具有显著意义（P<0.05）。与NS组及MS15组比较,MS360组的总移动距离、总速度、中心区移动距离、中心区持续时间均明显下降（P<0.05）。而MS15组与NS组无统计学差异（P>0.05）。（2）PND84天CUMS应激后大鼠体重及行为学比较PND84天大鼠体重比较,应用两因素方差分析[性别（F,M）与应激状态（NSNC,CUMS,MS15+CUMS,MS360+CUMS）]比较,结果显示性别以及应激因素均对体重有影响,差异有统计学意义（P<0.05）。而性别与应激状态之间无交互作用。进一步分析显示,PND84天雄性大鼠的体重明显高于雌性大鼠（P<0.05）,且MS360+CUMS组的体重均为最低,与NSNC组进行比较,体重均值具有明显的统计学差异（P<0.05）。行为学比较,SPT指标比较结果显示性别以及MS联合CUMS的应激状态对大鼠的糖水偏好指数均未见明显统计学影响,且交互作用无明显统计学意义（P>0.05）。FST不动时间比较,两因素方差分析检测发现性别以及应激状态对不动时间的主效应均未见明显的统计学意义,且在性别与应激状态间缺乏交互作用（P>0.05）。OFT比较,结果显示直立次数、总移动距离以及总速度比较,性别与应激状态之间的交互作用显著（P<0.05）,且应激状态主效应具有显著意义（P<0.05）。中心区移动距离及中心区持续时间比较,应激状态主效应显著（P<0.05）,而性别主效应及交互作用不显著（P>0.05）。进一步分析发现雄性大鼠MS360+CUMS组旷场行为学表现最差,其次是CUMS组,MS15+CUMS组与NSNC组表现最好且两者之间无显著差异;雌性大鼠CUMS组行为学表现最差,其次是MS360+CUMS组,MS15+CUMS组与NSNC组表现最好且两者之间无显著差异。结论:长期母婴分离会损害雌性以及雄性大鼠成年后的行为学表现,使其表现出类似抑郁样行为,而短期母婴分离并未影响大鼠成年后的行为学表现。成年后再次遭受应激后,早年经历长期母婴分离的雄性大鼠表现为应激敏感,比未经历过母婴分离的雄性大鼠表现更差,而短期母婴分离使雄性大鼠对成年后再应激具有应激弹性,避免行为学损害;而在雌性大鼠,成年再遭受应激后,未经历过母婴分离的大鼠行为学表现最差;与未经历母婴分离相比,长期母婴分离亦对应激弹性具有一定的促进作用,短期母婴分离具有显著的促进应激弹性的作用。第二部分母婴分离应激联合成年后CUMS应激对雄性SD大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的影响目的:检测不同程度的早年母婴分离应激（MS）对成年雄性SD大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的影响;以及成年CUMS后,不同程度的MS联合CUMS应激对雄性SD大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的影响。方法:早年MS结束后待大鼠成年,处死取材,免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测大鼠海马CRMP2与微管蛋白tubulin以及微丝蛋白actin之间的相互作用。免疫荧光（Immunofluorescene,IF）检测大鼠海马CRMP2与tubulin及actin的共表达共定位情况。并应用q-RT-PCR检测不同MS应激状态（NS,MS15,MS360）对大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架相关蛋白m RNA表达的影响,应用WB技术检测不同MS应激状态对大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路蛋白水平及磷酸化水平,以及微管动态性相关蛋白Tyr-tubulin、Acet-tubulin的蛋白表达的影响。成年CUMS应激后大鼠处死取材,采用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）技术及q-RT-PCR、WB技术检测不同程度的MS应激联合CUMS应激（NSNC,CUMS,MS15+CUMS,MS360+CUMS）对大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路蛋白及骨架蛋白表达的影响。结果:（1）不同程度MS应激对海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的影响免疫共沉淀结果显示大鼠海马CRMP2与微管蛋白tubulin之间存在相互作用,而与actin未检测到相互作用。免疫荧光显示海马CA1区、CA3区、DG区,CRMP2与tubulin及actin均存在共定位表达。成年CUMS应激之前,长期MS及短期MS均未影响大鼠海马Akt、CRMP2、tubulin、actin的m RNA表达水平,与NS组无差异（P>0.05）;而短期MS及长期MS均明显降低了海马GSK3β的m RNA表达水平,与NS组差异显著（P<0.05）,短期分离组与长期分离组之间无明显差异（P>0.05）。长期MS可明显降低P-Akt的表达水平,而对Akt的水平无影响;MS15及MS360均降低了海马GSK3β的表达水平,而只有MS360降低了P-GSK3β的水平,MS15无影响。MS360使P-CRMP2的水平明显升高,而对总的CRMP2水平无明显影响,对微丝蛋白actin亦无明显影响。MS360明显降低了动态微管标志物Tyr-tubulin的表达水平,升高了Acet-tubulin的表达水平,而MS15对其水平无影响;MS360及MS15均未影响tubulin的表达水平。（2）不同程度MS应激联合CUMS应激对海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的影响免疫组化结果显示与NSNC组以及MS15+CUMS组相比,CUMS组及MS360+CUMS组的CRMP2表达水平在CA1区、CA3区以及DG区均下调,差异有统计学意义（P<0.05）。此外,比较P-CRMP2的表达水平发现,与NSNC组以及MS15+CUMS组对比,CUMS组及MS360+CUMS组的P-CRMP2表达水平在CA1区、CA3区以及DG区呈现上调趋势,差异显著（P<0.05）。q-RT-PCR结果比较,四组的Akt、tubulin以及actin的m RNA表达水平均无明显差异（P>0.05）。GSK3β的m RNA表达水平比较显示,与NSNC组对比,CUMS组及MS360+CUMS组的GSK3β水平明显下降,而MS15+CUMS组与NSNC组无明显差异。CRMP2的m RNA水平比较显示,与NSNC组对比,CUMS组以及MS360+CUMS组的CRMP2水平均明显下降,且均低于MS15+CUMS组;MS15+CUMS组与NSNC组相比无明显差异。WB结果比较,给予CUMS应激显著降低了大鼠海马的P-Akt的蛋白表达水平,而对Akt总体表达水平无明显影响;MS360+CUMS亦降低了P-Akt的表达水平,而MS15+CUMS未降低P-Akt水平。CUMS以及MS360+CUMS均明显降低P-GSK3β水平,而MS15+CUMS无明显影响;虽然差异未达到统计学标准,CUMS组以及MS360+CUMS组大鼠的GSK3β水平较NSNC及MS15+CUMS组有下降的趋势。CUMS与MS360+CUMS组使P-CRMP2水平显著升高,而MS15+CUMS并未升高;CUMS及MS360+CUMS组的CRMP2水平较NSNC及MS15+CUMS组下降,差异达到统计学标准（P<0.05）。微丝蛋白actin在四组中无明显差异,tubulin亦为未发现显著差异。Tyr-tubulin的比较显示,与NSNC及MS15+CUMS相比,CUMS组及MS360+CUMS组水平均下降,而两组的Acet-tubulin蛋白水平亦升高,差异达到统计学标准（P<0.05）;MS15+CUMS与NSNC组未见明显差异（P>0.05）。结论:大鼠海马CRMP2与微管蛋白tubulin之间存在相互作用。早年长期MS应激可明显改变海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路磷酸化蛋白的表达,提高P-CRMP2的表达水平,并降低微管动态性蛋白的表达,而短期MS应激无明显影响。早年长期MS联合CUMS应激以及单纯的CUMS应激可明显降低CRMP2的表达水平,并影响海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路磷酸化蛋白的表达,提高P-CRMP2的表达水平,并降低微管动态性蛋白的表达,而短期MS联合CUMS并未影响其表达。提示长期MS促进应激敏感的作用机制以及短期MS促进应激弹性的作用可能与海马Akt/GSK3β/CRMP2信号通路及骨架蛋白的调节有关。第三部分CRMP2及P-CRMP2水平改变对SD大鼠行为学及骨架蛋白的影响目的:探讨海马立体注射PI3K抑制剂LY294002对Akt/GSK3β/CRMP2通路蛋白的磷酸化水平以及微管动态性相关蛋白水平的影响,以及CRMP2磷酸化水平改变对大鼠行为学的影响。探讨海马立体注射CRMP2干扰慢病毒对大鼠海马CRMP2及微管动态性相关蛋白水平的影响,以及其表达水平改变对大鼠行为学影响。方法:6-8周龄的雄性SD大鼠分为四组,LY294002组、溶剂DMSO组,以及siCRMP2组、siCON组。LY294002组以及DMSO组首先进行两侧海马CA1区（-3.5mm,±2.3mm,-2.6mm）立体定位置管,置管后恢复2周,然后给予两侧定位注射LY294002（5m M,用DMSO溶解）每侧2ul,DMSO组每侧注射2ul DMSO。注射后30min进行行为学检测,包括SPT、FST以及OFT,检测结束后处死取材,q-RT-PCR检测Akt、GSK3β、CRMP2、actin及tubulin的m RNA表达水平,WB检测Akt/GSK3β/CRMP2通路蛋白及磷酸化蛋白水平,以及微管动态性相关蛋白Tyr-tubulin及Acet-tubulin的表达水平。siCRMP2组海马CA1区（-3.5mm,±2.3mm,-2.6mm）脑立体注射LV-CRMP2-RNAi病毒,siCON组注射阴性对照病毒,2周后进行行为学检测,包括SPT、FST以及OFT,检测结束后处死取材,免疫荧光检测海马CA1区GFP蛋白的表达情况,q-RT-PCR检测CRMP2的m RNA表达水平变化,WB检测CRMP2、Tyr-tubulin及Acet-tubulin的蛋白表达水平变化。结果:（1）海马立体注射LY294002对大鼠行为学及Akt/GSK3β/CRMP2通路蛋白的影响海马注射LY294002后明显降低了大鼠OFT中的中心移动距离以及中心持续时间,差异与DMSO组有统计学意义（P<0.05）。直立次数、总移动距离、总速度虽然差异未达到统计学标准,但LY294002组仍有较明显的下降趋势。FST检测结果显示LY294002组大鼠的不动时间有升高的趋势,但差异未达到统计学意义标准。SPT结果显示两组无明显差异（P>0.05）。q-RT-PCR结果显示LY294002组大鼠海马的Akt、GSK3β、tubulin以及actin的m RNA表达水平均与DMSO组无显著差异;而CRMP2的m RNA表达水平显著低于DMSO组（P<0.05）。WB检测显示LY294002注射可导致P-Akt及P-GSK3β的水平的降低,对Akt及GSK3β蛋白的总体水平无影响。LY294002使CRMP2水平降低,同时升高了P-CRMP2的表达水平,并导致Tyr-tubulin水平下降,Acet-tubulin水平升高,提示微管动态性受损。（2）干扰CRMP2表达对大鼠行为学影响及相关机制研究海马定位注射CRMP2干扰慢病毒后两周,FST比较发现与siCON组相比,siCRMP2组大鼠的不动时间显著升高（P<0.05）。糖水偏好指数比较,两组之间无统计学差异。OFT结果显示,与siCON组比较,siCRMP2组大鼠的直立次数（P<0.01）、总距离（P<0.05）、总速度（P<0.05）均显著下降,差异有统计学意义。免疫荧光检测CA1区有明显的GFP荧光,提示注射位置正确。siCRMP2组大鼠的海马CRMP2的m RNA水平明显下降（P<0.05）。WB检测亦发现siCRMP2组大鼠海马的CRMP2蛋白表达水平下降,并且Tyr-tubulin表达水平亦下降,而Acet-tubulin表达水平升高,与siCON组差异有统计学意义（P<0.05）。结论:调节大鼠海马Akt/GSK3β/CRMP2通路蛋白的磷酸化水平,升高P-CRMP2的水平可导致微管动态性相关蛋白表达水平的改变,并导致大鼠行为学表现受损。干扰大鼠海马CRMP2的表达水平,亦可导致微管动态性相关蛋白表达水平的改变,并导致大鼠出现类似抑郁样行为。