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本文采用RACE方法克隆了HWTX-Ⅴ的cDNA,并将其归类于超家族中。根据毒素的氨基酸序列设计RACE引物,通过叠合3’RACE和5’RACE扩增的序列就得到了毒素蛋白的cDNA全序列。HWTX-Ⅴ的全长cDNA共有459个碱基。由5’UTR、可读框和3’UTR组成,将其与其它虎纹捕鸟蛛的毒素cDNA进行同源比较,同时将Pre和Pro区与其他己知毒素的Pre和Pro区比较,结果表明HWTX-Ⅴ的核苷酸序列在Pre和Pro区与HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ高度同源,而与HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅶ的同源性较低。由此可知HWTX-Ⅴ,HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅳ属同一超家族,从而可以预测HWTX-Ⅴ的三级结构同HWTX-Ⅰ一样,六个半胱氨酸残基都通过C1-C4,C2-C5,C3-C6的配对方式形成抑制剂半胱氨酸结模体(ICK)。
本文采用RACE方法克隆了5种敬钊缨毛蛛的全长cDNA序列,它们都由5’UTR、可读框和3’UTR组成,其开放阅读框编码一个20-23个氨基酸残基组成的信号肽区域,一个30多个氨基酸残基组成的成熟蛋白区域和一个介于它们之间的pro区域构成的毒素前体。这几种毒素的pro区变化较大,从几个氨基酸残基(JZTX-Ⅰ,Ⅲ,Ⅶ)到30多个(JZTX-Ⅸ)氨基酸残基不等,且它们的同源性较低。
蜘蛛毒素蛋白由于其序列短而富含二硫键,所以采用基因工程的方法表达困难,本文采用原核分泌表达载体pMAL-p2X成功表达了HWTX-Ⅳ,产率为0.4mg/L。由人工合成的HWTX-Ⅳ基因在5’端加上编码thrombin识别序列后,被克隆到原核分泌表达载体pMAL-p2X中,重组载体被命名为pMAL-p2X/HWTX-Ⅳ。pMAL-p2X/HWTX-Ⅳ转化DH5α感受态细胞,0.3mmol/LIPTG诱导表达4h后,16.5﹪TrcineSDS-PAGE鉴定,电泳结果表明HWTX-Ⅳ在E.coliDH5α中以融合蛋白的形式被分泌表达。扩大培养,培养液离心,取沉淀。沉淀经冷渗透休克,渗透液上清透析脱盐、冻干。融合蛋白的产率为20mg/L,融合蛋白用凝血酶酶切后,SuperdexTM75分子筛分离,目的蛋白再经C18反相柱脱盐纯化、冻干,rHWTX-Ⅳ的产率为0.4mg/L,膜片钳定性实验表明重组HWTX-Ⅳ与天然HWTX-Ⅳ有一致的生物活性。