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第一部分:骨癌痛大鼠脊髓中WNK1表达的变化目的探讨骨癌痛模型大鼠的脊髓中WNK1激酶的表达变化。方法健康雌性SD大鼠36只,体重180~220g,随机分为3组:对照组(C组)、假手术组(S组)和骨癌痛组(BCP组)。C组不给予干预,S组在左胫骨上端注射PBS液5μl、BCP组注射WALKER 256乳腺癌细胞5μl(约1×10~5个细胞)。于模型制备前1天以及制备后第3、6、9、10、11、12天测定大鼠机械痛阈。C组与S组于术后第12天、BCP组于模型制备后第3、6、9、12天时处死大鼠并取脊髓(L4~6)。运用qRT-PCR及Western blot进行不同时间点的WNK1 mRNA及其蛋白水平的检测。结果与C组比较,BCP组大鼠机械痛阈于第6天后下降(p<0.01),且BCP组脊髓中WNK1 mRNA在造模后第3天起表达上调,于第9天达到峰值(p<0.05);WNK1蛋白在造模后第6天表达上调,于第12天达到峰值(p<0.01)。结论骨癌痛大鼠脊髓中WNK1激酶表达显著上调。第二部分:鞘内注射WNK1 siRNA对脊髓KCC2表达及大鼠骨癌痛的影响目的研究WNK1 siRNA鞘内注射对KCC2表达及对骨癌痛大鼠痛阈的影响。方法设计并合成针对WNK1的siRNA 3对(siRNA-3498、siRNA-5003、siRNA-5461),在lipofectamine2000介导下转染体外PC12神经细胞系。PC12细胞分为6组(每组3复孔):control组、vehicle组、mismatch组、siRNA-3498组、siRNA-5003组、siRNA-5461组。转染24h后运用qRT-PCR、48h后运用Western blot法测量各组WNK1 siRNA的抑制率,筛选体外细胞转染的WNK1 siRNA。健康雌性SD大鼠30只体重180~220g,随机分为5组:假手术组(S组)、骨癌痛组(BCP组)、siRNA-3498组(骨癌痛+鞘内注射WNK1 siRNA)、mismatch组(骨癌痛+鞘内注射错配siRNA)、vehicle组(骨癌痛+鞘内注射在体转染试剂jetPEI)。造模后9~12d分别鞘内注射WNK1siRNA、错配的siRNA、jetPEI 0.36μl,siRNA用量3μg/10μl,每天1次。于模型制备前1天以及制备后第3、6、9、10、11、12天测定大鼠机械痛阈。造模后第12天处死大鼠并取脊髓(L4~6),运用qRT-PCR及Western blot方法检测脊髓中WNK1和KCC2的表达变化。结果与S组比较,BCP组大鼠脊髓WNK1表达增加(p<0.01),KCC2 mRNA和蛋白表达均下降(p<0.01)。与BCP组比较,鞘内注射WNK1 siRNA后大鼠脊髓中WNK1 mRNA下调(p<0.01),而KCC2 mRNA与蛋白表达均上调(p<0.01);同时vehicle组或mismatch组上述指标无明显差别(p>0.05);而连续3天鞘内注射WNK1siRNA后能显著提高骨癌痛大鼠的机械痛阈(p<0.01)。结论鞘内注射WNK1 siRNA能上调大鼠骨髓中KCC2的表达从而部分缓解大鼠骨癌痛。