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单克隆抗体靶标明确，临床应用安全性好、疗效明显，目前共有10个肿瘤单克隆抗体经美国FDA批准上市销售，已成为多种类型恶性肿瘤治疗的一线药物。然而，肿瘤是由异质性细胞群体组成，单一靶点的治疗只针对一部分肿瘤细胞发挥疗效，而其它肿瘤细胞则可能逃脱治疗，成为肿瘤复发的根源。因而，研制多靶点的类抗体蛋白药物已成为肿瘤治疗领域的一大热点。程序性死亡分子1（programmed death-1receptor，PD-1）是B7-CD28家族中的一员，它与其配体PD-L1和PD-L2结合的通路在T细胞应答中起了抑制作用。近日，莫菲特癌症中心研究发现，20%~25%包括非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤或肾细胞癌患者在使用PD-1单克隆抗体时完全有反应或是出现部分反应。目前，关于抗PD-1单抗的免疫学和分子学临床2期试验正在进行中，抗PD-1抗体治疗NSCLC，黑素瘤，以及肾细胞癌的临床3期试验已提上日程。因此，PD-1已经成为治疗癌症的重要靶点。血管生成因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是一种促血管生成因子。作为世界首个抗VEGF的抗体，阿瓦斯汀彻底改变了人类抗癌的传统模式，也是目前为止惟一被证实能够在多个癌症治疗领域显著延长患者总体生存期和无进展生存期的抗肿瘤血管生成药物，是2011年癌症药物的销量亚军。因此，以VEGF及其受体VEGFR为靶点治疗癌症是药物研究的热点。在本课题中，我们制备的融合蛋白PVP是一种双靶向的抗体，能同时靶向PD-1和VEGF。与传统的靶向药物靶向肿瘤细胞不同的是，PVP靶向的是T细胞，通过抑制T细胞失活，增强T细胞的杀肿瘤作用，并且能够在肿瘤微环境中靶向VEGF，使PVP的抗肿瘤疗效进一步提高。我们将PD-L2的胞外区与FLT1的第2结构域（FLT-1D2）通过连接片段相连接，构成基因PD-L2-Flt1D2，然后与IgG4的Fc段融合，得到我们所需的基因PD-L2-Flt1D2-Fc，该基因表达的蛋白具有靶向PD-1和VEGF的功能.然后我们使用5型腺病毒携带目的基因PD-L2-Flt1D2-Fc（PFF）基因，构建重组腺病毒Ad5-PFF。用重组腺病毒在体外感染293细胞，使其表达我们所需的融合蛋白（将该融合蛋白命名为PD-1-VEGF多靶向Fc融合蛋白，PVP）。收集重组腺病毒感染后的293细胞上清，用亲和层析的方法纯化出融合蛋白PVP，用western方法对蛋白进行定性，用生物分子相互作用分析仪对融合蛋白与靶向蛋白PD-1和VEGF的亲和力进行定量研究。研究结果显示我们制备的融合蛋白PVP与PD-1和VEGF均有较好的亲和力，并且能与活化T细胞表面的PD-1相结合。本课题的研究为PVP的体内抗肿瘤作用的研究奠定了基础。