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F-box蛋白,N端通常含有一个保守的F-box结构域,可以通过它与Skp1蛋白结合形成SCF（Skp1-Cullin-F-box）复合体,作为一类E3泛素连接酶参与到泛素-26S蛋白酶系统（UPS）中,再通过其C端具有结构多样性的蛋白质-蛋白质相互作用区域特异性识别并降解靶蛋白,根据C末端结构域的不同,可以将其分为不同的亚家族,例如常见的C末端具有kelch结构域的FBK亚家族,C末端具有F-box associated结构域的FBA亚家族等。F-box蛋白通过泛素化降解靶标蛋白从而调节细胞活动,响应植物生物或非生物胁迫、参与植物生长发育等过程,所以对于F-box蛋白的功能研究主要通过蛋白质相互作用研究技术筛选其降解的靶蛋白进行功能探究。桑树（Morus alba L.）,是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）植物,其果实桑椹经青果期,转色期以及成熟期三个阶段发育成熟,果实色泽是衡量果实成熟程度的主要性状之一,同时也与桑椹的品质密切相关。前期我们鉴定到两个在不同果色的桑椹中差异表达的F-box基因,并对其是否在果实着色过程中发挥功能展开探究。我们初步鉴定并分析了桑树F-box基因家族,为后续对于候选基因MaFBA380、MaFBK70的功能探究奠定基础;分析7个不同果色桑树品种成熟果实以及不同发育时期的桑树果实中目的基因表达量,从而分析目的基因与果实着色的相关性;通过叶盘转化法获得过表达转基因烟草株系,并获得MaFBA380、MaFBK70基因的拟南芥同源基因纯合突变体株系,然后通过转基因材料初步对目的基因的功能进行研究,从而探究桑树F-box蛋白MaFBA380、MaFBK70与果实着色的关系;通过蛋白质相互作用研究技术筛选MaFBA380、MaFBK70泛素化降解的靶标蛋白进一步探究其功能。获得的主要研究结果如下:1.桑树F-box蛋白家族的鉴定与分析通过F-box的隐马可夫模型从川桑蛋白质组数据库检索到164个成员。并对C-末端区域进行鉴定,鉴定出15个C-末端结构域,根据C-末端结构域,将其分为16个亚家族。对桑树F-box蛋白进行系统发育关系分析,结果显示,C末端结构域相同或相似的蛋白聚类在一起。2.桑树MaFBA380、MaFBK70的表达分析与克隆对于我们鉴定到的两个候选基因MaFBA380、MaFBK70进行表达模式分析,结果表明不同品种的成熟果实中,MaFBA380在桑椹颜色为紫色、红色的桑树品种中表达量显著高于白色品种,在果实的不同发育时期,MaFBA380在青果期表达量低,成熟果实中表达量高,差异显著;MaFBK70则是在桑椹果色呈白色的“珍珠白”品种中高表达,且基因表达量在桑椹果实转色期有显著上升。从不同品种中克隆MaFBA380、MaFBK70编码序列,并与川桑电子序列比较,结果显示,在不同品种桑树中两个基因序列没有大片段丢失也没有转录提前终止,基因序列相似性非常高,排除基因由于天然突变引起其蛋白功能差异的可能。对两个基因蛋白结构域进行分析,发现两个基因N端都具有保守的F-box结构域,其中,MaFBA380在C末端有一个FBA结构域,而MaFBK70则是在C端有3个重复的kelch结构域。3.桑树MaFBA380、MaFBK70功能验证获得过表达MaFBA380、MaFBK70烟草阳性植株各三株,观察烟草植株表型,结果显示两个基因的转基因烟草植株的花朵都仍为白色,叶片、茎中均没有花青素的积累,种子种皮颜色没有明显加深,但叶片颜色和野生型比较都有一定的变浅,呈现出更浅的淡绿色,除此之外并无明显性状改变;对花青素合成通路基因进行表达量检测,发现在MaFBA380转基因烟草中部分基因表达量显著上调,而在MaFBK70过表达植株中无显著差异;对叶绿素含量进行检测,发现在转基因烟草植株中叶绿素含量均低于野生型,但差异并不十分显著;获得MaFBA380、MaFBK70的拟南芥同源基因的T-DNA插入型突变体,通过三引物法鉴定到拟南芥fbk70及fba380纯合突变体各三株;对突变体的表型进行观察,均没有发现明显的花青素和叶绿素的积累或者降解,也没有其他矮化等表型;对fbk70突变体中花青素合成相关基因进行定量分析,发现没有显著差异;检测fba380莲座叶中花青素合成通路基因表达量,发现CHS,CHI,PAL,MYB114等基因显著下调表达。4.蛋白质相互作用研究技术筛选MaFBA380、MaFBK70的靶标蛋白首先,为了探究MaFBA380、MaFBK70是否参与UPS途径降解靶标蛋白,通过酵母双杂交技术验证了2个F-box蛋白均与Ma Skp1A相互作用,表明都能够与Skp蛋白结合形成E3泛素连接酶。然后对它们的靶标蛋白进行鉴定,前期筛选到4个与MaFBA380蛋白可能存在相互作用的蛋白质（Ma Mal D、Ma Lhc1、Ma CTP、Ma RPN11）作为候选蛋白,同时也筛选到3个MaFBK70的候选靶蛋白（Ma GS、Ma RRP、Ma PPO）,通过酵母双杂交技术验证相互作用,结果表明MaFBA380与Ma Lhc1、Ma CTP、Ma RPN11以及MaFBK70与Ma GS、Ma RRP、Ma PPO可能存在相互作用,但MaFBA380与Ma Lhc1、Ma RPN11相互作用可能比较弱。表明MaFBA380可能一方面调控花青素的合成积累,另一方面通过与叶绿素a-b结合蛋白Lhc1相互作用使其降解,影响叶绿素的合成积累,从而协调叶绿素和花青素的含量来调控果实转色。而MaFBK70则可能是通过与Ma GS相互作用影响叶绿素的合成从而调控果实转色,而与花青素的关联性不大。