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在得到公认的、7种植物所必需的微量元素中,Cl元素虽然是最晚被发现的,但对植物正常的生长和发育过程起着举足轻重的作用。目前,氯离子通道(Chloride Charmel,CLC)一般被认为与渗透调节、气孔运动、营养物质运输、金属耐性、信号识别与转导等诸多功能有关。关于植物氯离子通道蛋白全序列克隆和功能的研究开展起步较哺乳动物晚,而且多在拟南芥、烟草等双子叶植物中进行。水稻作为单子叶植物的代表植物和最重要的粮食经济作物之一,关于氯离子通道的研究报道并不多见。
本研究在水稻全基因组测序基本完成的前提和基础上,利用抑制消减杂交法(SSH)建立的水稻分化愈伤组织对愈伤组织的差减文库,针对特异性表达的EST序列进行分析和设计,首次从粳稻品种武进9998-3中分离到一个氯离子通道蛋白编码全长基因OsCLC,并对其表达谱和功能进行了初步的研究,其主要结果如下:
1)以粳稻品种武进9998-3为材料,扩增出一个2429bp的全长cDNA序列 OsCLC(登录号:DQ272692)。该序列具有完整的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码808个氨基酸,结构预测表明OsCLC具有11个疏水跨膜区、1个电压门控的氯离子通道结构(Voltage CLC)、1个胱硫醚β-合酶(Cystathionine-beta-synthase,CBS)结构域和3个与阴离子选择性有关的高度保守区(GSGIPE、GKAGPLVH和PVGGVLF);与烟草CLC-Ntl、拟南芥AtCLC-a、AtCLC-b、AtCLC-c、AtCLC-d和水稻日本晴OsCLC-1、OsCLC-2相似程度分别达到59%、54%、52%、58%、47%、63%和63%;
2)用乙酸锂转化法将OsCLC基因导入酿酒酵母单一的氯离子通道基因ScCLC(Gefl)缺失的突变菌株中进行功能互补实验,可使其在添加有NaCl的培养基上生长功能得到部分恢复,且互补程度在高盐浓度下更加明显;同时在培养基中添加CaCl<,2>、KCl、MgCl<,2>(Cl<->浓度为500 mmol/L)的结果显示:不同类型的阳离子对OsCLC的互补作用无影响;这些结果提示我们OsCLC基因可能在细胞内起到平衡质子电荷的作用。
3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)SYBR Green I荧光染料法检测OsCLC基因表达谱分析表明:
a)该基因在水稻的幼穗、旗叶、叶鞘、根、节、节间、叶、愈伤、芽点等组织中均有表达,根中的表达量最高;与日本晴的OsCLC-1表达情况类似,属于非组织特异性表达基因。
B)在0、50、100、200 mmol/LNaCl胁迫下,其表达量与盐浓度、胁迫时间相关:盐胁迫环境下生长1hr后,200 mmol/L NaCl胁迫下的表达量陡升至2.70倍,0、50、100 mmol/LNaCl基本无变化;8hr后50、100 mmol/L NaCl胁迫下的表达量分别达到2.74倍和3.16倍,同时200 mmol/LNaCl胁迫下的表达量却已降低至1.52倍;16hr后各浓度胁迫下的表达量均回落到起始量并再无明显变化。推测该基因在盐胁迫环境下能快速响应表达上调,通过氯离子外排参与调控水稻对净氯离子的吸收,增加水稻的耐盐性,降低盐化对水稻生长的影响。