鸡蛋主要蛋白及氨基酸调控CacO-2细胞胆固醇吸收转运及其机理研究

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鸡蛋胆固醇的摄入与人体血清胆固醇的浓度是否呈正相关性一直是一个具有争议性的问题。针对这一问题本研究以鸡蛋的主要蛋白质为研究对象,通过细胞实验研究其对胆固醇吸收的影响。通过分子生物学的技术手段探究鸡蛋蛋白质对胆固醇代谢通路的调控作用。具体研究内容和研究结果如下:  (1)建立一种新的快速培养Caco-2单细胞层的方法,分别研究细胞跨膜电阻值(TEER)、亲水标志物的渗透性、关键蛋白基因的表达、细胞膜特征形态等评价模型的完整性。发现快速培养法(9 d)获得的Caco-2模型跨膜电阻值(TEER)>220Ω·cm2;漏出标志物荧光黄表观分配系数为(0.39±0.15)×10-6 cm/s; Apical碱性磷酸酶(AKP)活性显著升高,培养至第9d时Apical/Basolateral的AKP比值为5.481±0.5304单细胞层极性分化明显;细胞模上的关键蛋白质mRNA转录水平同标准培养法无显著差异。此法建立的细胞模型缩短培养时间57%,仅培养9d即可形成完整细胞模型。  (2)探究鸡蛋主要蛋白质对胆固醇吸收转运的调控作用。运用CCK-8法测定OVA、OTf、 OV、酪蛋白对Caco-2细胞活性的影响。将Caco-2细胞分别与OVA、OTf、 OV、酪蛋白孵育然后进行细胞吸收实验,实验结果表明鸡蛋蛋白质孵育后的显著抑制Caco-2细胞对胆固醇的吸收;在Transwell12孔板上培养Caco-2细胞模拟小肠上皮细胞,研究了鸡蛋蛋白质对胆固醇转运的影响,结果表明加入OVA、OTf能抑制了胆固醇的转运而OV对胆固醇的转运没有影响。  (3)研究三种蛋白对微胶混合液中胆固醇溶解度的影响;对胆固醇吸收通路中关键蛋白NPC1L1表达量的影响;对关键基因ABCG5/G8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1与SREBP2的转录水平的影响。结果发现OVA、OTf均能降低胆固醇的溶解度,OV无显著的抑制效果;加入蛋白质之后Caco-2细胞中NPC1L1蛋白的翻译量显著的减少;采用RT-qPCR检测了细胞中ABCG5/G8、ACAT2、MTP、ABCA1、SREBP1与SREBP2的转录水平。OVA、OTf、OV可以上调ABCG5/G8、ABCA1的mRNA表达量,下调MTP的转录水平。  (4)研究氨基酸对胆固醇在微胶束中溶解度的影响,探究氨基酸对Caco-2细胞单层模型胆固醇的吸收调控作用,探索胆固醇吸收通路中关键基因转录语翻译水平表达的变化。丝氨酸浓度为50μg/mL和半胱氨酸的添加浓度为100μg/mL时胆固醇在混合微胶束中的浓度显著下降,说明氨基酸能够降低微胶束中胆固醇的溶解度。细胞吸收实验表明Ser能够抑制Caco-2细胞单层对胆固醇的吸收,但是Cys对细胞胆固醇吸收无明显效果。RT-qPCR检测到Cys与Ser孵育之后细胞内ABCG8、MTP的mRNA转录水平上调,下调ABCA1的转录水平对ABCG-5的表达无显著影响。
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