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背景第七次全国人口普查显示中国将进入人口零增长乃至负增长时代,这将深刻影响着高质量发展的劳动力供给量、消费者需求量等。2020年我国育龄妇女总和生育率仅为1.3,已经处于同比中的较低水平,而目前一般认为要维持正常的人口更替水平,育龄妇女总和生育率不应低于2.1,可见我国目前的生育状况不容乐观。生育力降低,不孕不育发病率增加是导致低生育水平的主要原因之一。不孕症临床定义是指育龄夫妇无避孕正常性生活至少12个月而未孕。近年来中国育龄夫妇的不孕率高达15%,高于世界水平。据文献统计报道显示,其中有40%以上的不孕不育问题是由男性因素造成,而其中男性精液质量低下是主要原因。影响男性精液质量的因素众多,包括遗传、环境及两者共同作用的因素。关于环境影响精液质量的文章国内外并不少见,涉及的影响因素包括电离辐射、化学物质、大气污染、噪音等,但主要集中在某一个具体影响因素上,而往往忽视了各种因素的交互作用。与遗传因素导致的精液质量低下相比,环境对精子的影响往往可以通过改善不良生活习惯、避免接触危险因子得以改善,因此意义重大。miRNA是一类长度约20nt的单链RNA,miRNA的存在是一种基因调控的重要方式,miRNA一般通过与m RNA结合阻遏翻译来调节转录后基因沉默,从而参与各种生理过程。而miRNA的表达会因为机体周遭环境及个人行为的变化而变化从而令人体可以适应环境的变化。这一表观遗传物质的转录后基因表达调控能力与男性生殖细胞的发生发育过程有着密切的相关性。将特定环境因素和男性生殖细胞发育相关miRNA的表达变化联系在一起并探索miRNA在精子发育的作用,有助于进一步了解男性生精过程的分子机制,寻找针对男性不育的有效生物标志物和防治策略,更是对于提高出生人口素质有十分重要的意义。另外,自然受孕是夫妻双方共同努力的结果。因此,本项目同步研究了Lnc RNA MIR2052HG基因多态性与女性复发性流产易感性的关联,但遗憾并未发现相关性。综上所述,我们课题组通过综合分析拟生育夫妇的日常高危因素暴露以及影响精液质量的日常生活因素,并结合通过miRNA测序筛选男性生殖细胞发生发育相关miRNA的表达水平,进而探讨差异表达miRNA在生殖细胞发生发育中的具体作用,为男性不育提供分子诊断标志物及潜在的治疗靶点。方法一.临床数据及问卷调查数据收集通过高龄高危生育评估门诊建立家庭档案库,所有孕前评估家庭在入组时均已经签署知情同意书,收集入组夫妇临床信息、流行病学调查资料,并完成相关血液学、影像学、精液常规检测,部分患者考虑有遗传因素影响将进行相关遗传学检测,并排除在本研究之外。本项目统计分析了精液质量指标与就诊者的人口学特征（年龄、婚姻、文化水平、籍贯、怀孕及生育次数、妊娠及分娩次数、避孕与受孕方式、孕前健康状况、吸烟、饮酒、既往其他疾病史、家族史等）、居住环境（居所范围2公里内有无化工厂、电话基站、广播发射塔、高压线等、家庭饮用水种类、半年内是否购买新车等）、工作条件和工作环境（是否接触有毒物质、是否有需要长期站立或坐下、每天使用电脑的时长等）的相关性。二.细胞模型构建及分子生物学实验miRNA测序筛选10例少精症和10例正常精液样本间显著差异表达的miRNA,选择差异最显著的miRNA作为目的miRNA;在GC-2 spd细胞模型中抑制和过表达目的miRNA,采用CCK8法检测小鼠GC-2 spd精母细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,采用q RT-PCR和蛋白印迹检测凋亡相关基因表达水平;通过多个在线软件筛选靶miRNA的可能靶基因,并采用Luciferase reporter assay、q RT-PCR、Western blotting进行验证;q RT-PCR检测目的miRNA及其靶基因在正常精液和少精症患者精液中的表达;通过曲线拟合预测人精浆中miR-296-5p表达与精子总数的关系。三.基于Taq Man法的基因分型及分析以对照组及病例组全血DNA为模板,利用Taq Man法对Lnc RNA MIR2052HG的多态性位点rs3802201进行基因分型,并使用SAS 9.4进行统计学分析:使用拟合优度（Goodness-of-fit）检验判断对照组中rs3802201的基因型频率分布是否满足Handy-Weinberg遗传平衡定律;使用单因素logistics和多因素logistics回归分析计算优势比（OR）和95%置信区间（95%CI）以及调整年龄可能带来的混杂作用。结果1.问卷数据和精液常规数据联合分析结果显示:研究人群在高压线（是:283.4×10~6/ml vs否:219.8×10~6/ml,P=0.030）、大型变电站（是:309.1×10~6/ml vs否222.4×10~6/ml,P=0.015）及配电站附近居住时精液中精子总数相对提高。其中居住房子邻近配电站的男性则有更高比例的前向运动精子（是:37.2%vs否:33.3%,P=0.030）。危险因素包括:具有半年内房屋装修经历的人群,精液中精子总数则明显下调（是:194.2×10~6/ml vs否:261.0×10~6/ml,P=0.025）;居住在化工厂附近的人群精液PH较高（是:7.5 vs否:7.2,P=0.001）。电脑的长期使用会降低前向运动精子比例（小于1小时:35.9%vs 1至4小时:37.6%vs 5至8小时:35.9%vs大于8小时:28.6%,P=0.047）及精子总活力（小于1小时:58.5%vs 1至4小时:56.5%vs 5至8小时:56.0%vs大于8小时:41.0%,P=0.009）。2.miR-296-5p在少精症人群里面表达显著上升。成年男性精浆中miR-296-5p的相对表达量与精子总数呈现显著的负相关（P＜0.001）。3.过表达miR-296-5p可抑制GC-2 spd细胞活性和促进凋亡,抑制miR-296-5p可增加GC-2 spd细胞活性和抑制凋亡。4.生物信息学预测及双荧光素酶报告实验显示Gigyf1基因为miR-296-5p的靶基因,过表达miR-296-5p可抑制Gigyf1的表达,抑制miR-296-5p可促进Gigyf1的表达;过表达miR-296-5p可抑制Igf-1r蛋白的磷酸化,继而下调磷酸化Akt,并提高Bax（P＜0.001）、Cleaved-Caspase 3（P＜0.001）、P53（P＜0.01）的表达,同时减少了Bcl-2的表达（P＜0.01）。最终诱导小鼠精母细胞的凋亡,降低精母细胞的增殖活性。而且人精浆中miR-296-5p的表达与该次射精的精子总数呈负相关。5.我们的结果显示,没有证据表明MIR2052HG rs3802201 C＞G与复发性流产相关（CG and CC:adjusted OR=0.970,95%CI=0.694–1.355,p=0.8577;GG and CC:adjusted OR=0.74 3,95%CI=0.416–1.330,p=0.3174;dominant model:adjusted OR=0.925,95%CI=0.672–1.272,p=0.6298;recessive model:adjusted OR=0.751,95%CI=0.430–1.321,p=0.3233）。结论1.居住在高压线、变电站、配电站、化工厂附近,居所半年内曾装修过,长期使用电脑这几项因素与精液质量的变化明显相关,但多种生活环境因素有可能产生加性效应对精液质量造成一定的影响,更可靠的结果仍然需要在更大规模的人群及不同的人种中进行验证。2.miR-296-5p在少精子症病人的精浆中的表达显著高于正常精浆。3.miR-296-5p可抑制GC-2 spd细胞活性和促进凋亡,其可能的机制是靶向抑制Gigyf1,并调控Igf-1r通路本研究为将miR-296-5p发展成为少精子症的疾病生物标记物提供了理论依据。3.本次研究的结果并未发现MIR2052HG rs3802201 C＞G多态性与复发性流产的关系。