论文部分内容阅读
目的OHSS是一种人体组织自限性疾病,具有多种临床症状,与许多生化介质引起的毛细血管通透性增加和体液积水都相关,血管内皮生长因子（VEGF）是其中表现最突出的因子之一。女性不孕不育患者在接受hCG诱导排卵的过程中,剂量难于控制,因此过量hCG会导致卵泡发育过度,进而导致卵巢肿胀和毛细血管新生。由于异常增生的血管壁通透性非常高,血液极易渗入组织间隙引起不同程度的炎症。KS被发现具有抗血管、抗炎、抗间充质转化的功能,但在生殖系统疾病中的作用尚未进行探索。本课题旨在从OHSS患者血液上清样本和OHSS小鼠模型着手,采用细胞实验、分子实验等手段研究KS对血管、炎症的调控及机制、hCG在OHSS中是如何调控了KS的表达水平,为未来生殖系统疾病领域引入KS作为辅助治疗手段或临床药物转化提供新思路。方法第一部分1、ELISA测定正常组与OHSS患者组血液上清中KS、VEGF、IL-6、IL-8的含量,通过统计学手段确定:（1）正常组与OHSS组中KS的差异;（2）KS与VEGF、IL-6、IL-8的相关性。2、利用PMSG、hCG、Ad-GFP、Ad-KS体内构建小鼠OHSS病理预防模型:（1）收集眼眶血离心后的上清进行ELISA测定VEGF、IL-6、IL-8的含量;（2）小鼠尾静脉血管注射伊文思蓝后取抽取腹腔液测定OD值分析血管通透性的差异;（3）对小鼠体重进行统计分析并取卵巢组织进行称重与形态学观察,对比体重差异及卵巢囊肿的情况;（4）提取卵巢组织蛋白、RNA进行WB与qRT-PCR,分析VEGF的表达情况。3、使用装载KS启动子序列的腺病毒载体及阴性对照腺病毒对卵巢颗粒细胞系KGN和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC进行感染:（1）ELISA测定细胞培养液上清中KS、VEGF、IL-6、IL-8的表达情况;（2）qRT-PCR测定细胞RNA的VEGF、IL-6、IL-8表达水平;（3）WB测定细胞总蛋白的VEGF、IL-6、IL-8表达水平;（4）体外成管实验测定HUVEC的血管形成能力;（5）划痕实验、迁移实验测定HUVEC的迁移能力。第二部分1、探索KS对腺病毒感染后的KGN、HUVEC细胞Wnt/β-catenin信号通路和End-MT信号通路的调控:（1）细胞免疫荧光、WB/qRT-PCR测定KGN、HUVEC细胞中KS对β-catenin的影响;（2）使用LiCl处理KGN、HUVEC细胞,外源激动β-catenin信号通路,用迁移实验、WB研究KS对β-catenin及End-MT相关指标的测定。第三部分1、使用si-NR2F1/si-NC干扰卵巢颗粒细胞的NR2F1基因:WB/qRT-PCR检测KS在细胞中的表达水平。2、使用NR2F1质粒转染卵巢颗粒细胞:WB/qRT-PCR检测KS在细胞中的表达水平。结果第一部分1、ELISA结果显示正常组中的KS含量高于OHSS患者组,而正常组中的VEGF、IL-6、IL-8含量低于OHSS患者组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。2、（1）眼眶血的ELISA结果与第1点保持一致;（2）血管通透性检测结果显示OHSS组小鼠的血管渗透能力强于正常组小鼠,OHSS+Ad-KS组小鼠的血管渗透能力有所降低;（3）OHSS组小鼠的体重大于正常组小鼠且OHSS组小鼠左右卵巢明显大于正常组小鼠,OHSS+Ad-KS组小鼠体重小于OHSS组小鼠;（4）WB/qRT-PCR结果显示OHSS+Ad-KS组小鼠的VEGF表达水平均低于OHSS组小鼠,证实KS具有缓解卵巢组织肿大的功能。3、（1）细胞上清ELISA结果与临床患者血液样本、动物实验保持一致;（2）KS在mRNA水平上下调了细胞VEGF、IL-6、IL-8的表达水平;（3）KS在蛋白水平上下调了细胞VEGF、IL-6、IL-8的表达水平;（4）KS抑制HUVEC的体外血管生成;（5）KS抑制HUVEC的迁移能力。第二部分1、细胞免疫荧光、WB/qRT-PCR结果显示KS下调KGN、HUVEC细胞内β-catenin的表达;2、迁移实验、WB结果表明LiCl激动剂能够拮抗KS的作用,WB结果显示KS可以调控LRP6、VE-cadherin和Snail的表达水平。第三部分1、NR2F1基因被沉默后,WB/qRT-PCR结果表明KS的表达水平下降。2、NR2F1基因过表达后,WB/qRT-PCR结果表明KS的表达水平上升。结论第一部分:1、KS的抗血管、抗炎作用能够缓解OHSS症状。2、KS能够抑制血管内皮细胞的增殖、迁移特性。第二部分:1、KS能阻断Wnt/β-catenin信号通路。2、KS能抑制End-MT的发生发展。第三部分:1、hCG通过调控NR2F1基因下调KS的表达水平。总结:通过腺病毒载体过表达Kallistatin可以在OHSS中发挥抗血管的作用以缓解OHSS的发展,hCG在促进OHSS的过程中可通过NR2F1调控Kallistatin的表达。