论文部分内容阅读
背景可变多聚腺苷酸化（APA）是一种广泛存在于真核生物中的基因表达调控机制。作为一种转录后调控机制,APA能利用m RNA前体3’UTR区域的两个甚至多个可供RNA酶切割并完成后续加poly（A）尾过程的位点,使之产生多条不同长度的成熟m RNA变体。APA现象多发生于m RNA的3’UTR区域,也有部分发生于Intron、Exon等位置,依据发生位置的不同,可以将APA分为4类,分别为3’UTR-APA、Splicing APA、Intronic APA与Internal exon APA。这四种APA分别会产生不同类型的转录本亚型,而在不同的组织或生物学状态中往往存在不同类型的APA现象。例如在淋巴组织或免疫细胞中,主要存在的APA类型为Intronic APA,这种类型的APA通常会导致转录本部分编码区域的缺失,大多会影响后续翻译过程产生的蛋白质的功能与结构,与蛋白编码、免疫反应等生物学过程有着紧密的联系;而在肿瘤组织、衰老细胞或是增殖细胞等中,主要存在的APA类型为3’UTR-APA,这种类型的APA往往伴生m RNA表达量的改变,进而调控相关基因的蛋白表达水平,与细胞周期、RNA稳定性调节与降解等进程有着密切的关联。在本文中,我们主要关注的是与肿瘤发生发展相关的3’UTR-APA。Micro RNA（miRNA）是一类长度约为19-24 nt和参与m RNA稳定性调控与降解过程的内生小片段RNA。大部分miRNA在基因位置上保守,且序列上也存在高度同源性。每个miRNA可以有多个靶基因,多个miRNA也可以调节同一个靶基因。目前研究表明,miRNA多结合于m RNA前体的3’UTR区域,通过切割或阻断翻译等方式破坏m RNA的后续翻译进程并降解m RNA,进而参与细胞增殖、分化和凋亡等重要的生物学过程。由于APA机制的存在,大量长度不同的m RNA亚型极大提高了基因转录组水平的多样性,同时也伴生了很多特异的生物学功能。最近有研究表明,在肿瘤组织中许多基因表达出的m RNA较正常组织里的转录本而言存在明显的缩短现象。经过检测,这些表达短m RNA亚型的基因在癌症样本中的表达水平通常高于正常样本。我们推测这很可能是3’UTR的缩短引起miRNA结合位点的丢失,使m RNA前体逃避了miRNA的抑制与降解过程。目前,整合分析APA机制与miRNA结合位点改变,探究这一过程与癌症之间关联的研究较少。同时,相应的APA分析软件选择的筛选指标也还有待完善。因此,验证APA这一机制在肿瘤组织中发挥的作用,优化分析指标,筛选受影响的相关基因并探究潜在的miRNA位点变化,有利于更好地理解APA在癌症中的影响机制。目的探究APA具体的发生过程与优化调整APA分析软件的筛选指标;探究APA在肺腺癌中的影响以及筛选相关基因;寻找潜在的发挥重要调控功能的miRNA,挖掘APA影响基因表达水平背后的机理。材料我们从TCGA数据库中下载了3种癌与癌旁匹配的肿瘤样本的转录组数据（RNA-SEQ）作为预实验材料,分别用APA分析软件Da Pars和APAtrap按不同的筛选标准进行分析,评估合适的筛选标准与比较两种软件的差异以用于分析后续样本。我们选取了30对癌与癌旁匹配的肺腺癌病人转录组测序样本,利用Da Pars和APAtrap筛选了存在显著差异表达的APA事件,利用皮尔森相关性分析筛选出了与3’UTR缩短显著相关的APA事件。定义经过筛选表现为肿瘤组织中3’UTR缩短且富集在与肿瘤相关生物学过程的基因为ARTGenes。在TCGALUAD数据中对我们的筛选结果进行验证,定义了转录本事件3’UTR缺失率（Loss ratio,LR）,调整并优化了筛选标准。利用miRDB、Tarbasev8、miRTarbase、Target Scan数据库筛选潜在的受影响的miRNA。结果1.Da Pars分析时间更短,标准更宽松,仅能筛选一个近端APA位点;APAtrap分析时间更长,标准更严格,能预测多个近端APA位点并分别计算表达量。2.相关性分析结果显示,在筛选结果中有近50%基因在肿瘤组织中出现显著的3’UTR缩短现象。3.在LUAD样本中,多个ARTGenes生存分析结果显著。4.优化筛选标准后,3’UTR缺失率LR相比Da Pars和APAtrap的标准能更直观评估APA事件对3’UTR造成的影响。5.ARTGenes中,如CDC45、NUP155、PSMD12等受APA影响而3’UTR缩短,因此丢失大量miRNA结合位点。结论1.APAtrap比Da Pars预测更多APA位点,但耗时更长。2.大量与癌症进程相关的基因在肿瘤样本中出现显著的3’UTR缩短现象。3.经APA筛选的基因大部分在LUAD肿瘤组织中表达上调且与预后显著相关。4.3’UTR缺失率LR能降低筛选结果假阳性的可能,能更好评估转录本受APA事件的影响。5.大量miRNA结合位点在APA介导的3’UTR缩短现象中丢失,使相关基因丧失了miRNA介导调控并异常表达。