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天然CD4~+CD25~+调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)因具有强大的免疫抑制能力在器官移植领域引起了广泛的关注,可能成为诱导器官移植中诱导免疫耐受的有效手段之一,但由于Treg可应用的细胞数量过少限制了其临床应用。模拟体内条件对其进行的体外扩增取得了一定的成功,但这种方法耗时长,费用昂贵,实验条件要求高而无法推广。Foxp3属于FOX(fork head box)转录因子家族成员,对Treg的发生、发育、分化和生物学功能的发挥具有十分重要的作用。研究发现表达外源性Foxp3可使非调节性T细胞具Treg有的表型及免疫抑制功能。HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)基因编码的反式激活蛋白(transactivator TAT)中的蛋白转导结构域(protein transduction domainPTD)能够携带外源性蛋白穿过几乎所有的真核细胞膜进入细胞浆和核内。本实验室已成功地构建了小鼠pET28a-PTD-mFoxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了PTD-mFoxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实PTD-mFoxp3融合蛋白能有效的进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力。目的:初步研究PTD-mFoxp3融合蛋白在大鼠异位心肺联合移植中抗急性排斥的作用。方法:1、PTD-mFoxp3融合蛋白的制备:诱导、纯化和复性。2、建立大鼠器官移植模型:根据Lee设计的腹腔单一动脉吻合心肺联合移植模型,以BN大鼠为供体,Lewis大鼠为受体建立稳定可靠的大鼠异位心肺联合移植急性排异反应的模型,为研究实体器官移植后急性排斥反应建立动物模型。3、PTD-mFoxp3融合蛋白抗急性排斥的实验研究:受体大鼠术前1天尾静脉注射PTD-mFoxp3融合蛋白,术后同样连续干预7天,同法设立对照。通过观察异位心脏移植物的病理表现、存活时间及受体大鼠一般状况来评价PTD-mFoxp3融合蛋白抗大鼠异位心肺联合移植急性排斥的效果。结果:1、成功表达、纯化、复性PTD-mFoxp3融合蛋白。2、通过提高显微外科操作技、技能,改进供心保护方法,我们成功以BN大鼠为供体,Lewis大鼠为受体建立的大鼠腹部异位心肺联合移植模型,手术成功率可达85%以上。3、术后第三天,受体大鼠一般状况:环孢素和PTD-mFoxp3融合蛋白处理组大鼠一般状况明显好于空白和mFoxp3对照组,方差分析四组有显著差异(p＜0.001),两两比较融合蛋白组和环孢素组较空白对照和mFoxp3组之间有显著差异(p＜0.01),环孢素和PTD-mFoxp3融合蛋白组无显著差异(p＞0.5),mFoxp3与空白对照无显著差异(p＞0.5)。4、器官移植后第5天病理学检查:空白和阴性对照组异位心脏移植物可见大量淋巴细胞浸润及广泛的心肌变性、坏死,出血,炎症程度按stanford分级为4级。环孢素组和PTD-mFoxp3融合蛋白组病理表现相似,主要为心脏组织内局灶性血管周围和心肌间质炎症细胞浸润,心肌轻度水肿或局灶性心肌损伤,炎症分级为1A级或1B级。经秩和检验分析有显著差异(p＜0.01)。5、异位心肺联合移植后移植存活时间的观察:环孢素组为20±2.35天,PTD-mFoxp3组为19.4±2.70天,空白对照组为8.2±1.92天,mFoxp3组为7.4±1.14天,经方差分析四组之间有显著差异(p＜0.001)。两两比较PTD-mFoxp3组和环孢素组较空白对照和mFoxp3组之间有显著差异(p＜0.01),PTD-mFoxp3组和环孢素组无显著差异(p＞0.5),mFoxp3与空白对照无显著差异(p＞0.5)。结论:1、大鼠腹部异位心肺联合移植操作简单,方法易于掌握,我们在实验中成功建立了大鼠腹部心肺联合移植模型,证实大鼠腹部异位心肺联合移植模型具有一种稳定、可靠、易于推广的优点。2、在体内实验中证实静脉注入PTD-mFoxp3融合蛋白,具有明显延长大鼠腹部异位心肺联合移植物存活时间,减轻移植物炎症反应的能力,为研究人PTD-FOXP3融合蛋白的功能和其临床应用奠定了基础。