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bmi-1(b-cell specific moloney leukemia virus insertionsite 1,bmi-1)是一种属于PcG(Polycomb group,PcG)家族的原癌基因,它直接参与细胞生长、增殖的调控,并为成体干细胞和白血病干细胞的自我更新所必需。研究证实人类多种肿瘤,如淋巴瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、乳腺癌、肺癌及大肠癌等的发生、发展均与bmi-1基因表达异常有关。体外实验表明,bmi-1基因有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。RNA干扰是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程。确定靶位后,我们可利用RNA干扰技术对相关基因调节,进行抗肿瘤的基因治疗。
本课题通过研究bmi-1基因在SHI-1-CD34+细胞中的表达,探讨bmi-1基因与细胞增殖的关系；利用基因克隆技术构建适合的短发夹。RNA逆转录病毒表达载体,干扰bmi-1基因在白血病细胞内的表达,为临床肿瘤基因治疗提供理论依据。
方法：
1.细胞培养：白血病细胞株SHI-1细胞按悬浮细胞常规方式培养传代。
2.分选CD34+细胞：将适量的SHI-1细胞和脐血单个核细胞标记免疫磁珠CD34,利用免疫磁珠分选系统分选其中的CD34+细胞。
3.鉴定分选前后CD34+细胞的纯度：将收集到的分选前后细胞标记抗体CD34-PE、CD38-FITC后,流式细胞仪上机鉴定分选前后CD34+细胞的纯度。
4.分选前后细胞生长曲线绘制：将SHI-1、SHI-1-CD34~+、SHI-1-CD34-细胞调整细胞浓度为10~5ml~(-1),接种于24孔板内培养,每组设3个平行孔,于第0、1、2、3天计数细胞。
5.分离外周血单个核细胞：无菌抽取正常人外周血2ml,置于加有抗凝剂的15 ml离心管内,淋巴细胞分离液分离单个核细胞。
6.RT-PCR分析bmi-1基因在SHI-1-CD34~+细胞中的表达：以正常人外周血和脐血为对照,凝胶成像系统灰度扫描分析bmi-1基因在SHI-1-CD34+的表达；荧光定量PCR定量分析bmi-1基因在SHI-1、SHI-1-CD34~+、SHI-1-CD34-细胞中的表达差异。
7.获取逆转录病毒载体：将重组载体pSIREN-VEGF-C进行双酶切,电泳鉴定后回收目的片段。
8.构建及鉴定pSIREN-bmi-1逆转录病毒表达载体：设计短发夹结构的RNA干扰片段,通过退火、连接、转化等基因克隆技术构建重组载体pSIREN-bmi-1;挑取单克隆板上的两个阳性单克隆,送英骏生物公司测序鉴定。
结果：
1.流式细胞仪检测分选前SHI-1细胞中CD34~+细胞阳性率为6.4％,分选后CD34~+细胞纯度为99.6％。
2.绘制生长曲线发现分选前白血病细胞SHI-1呈指数生长,分选后细胞增殖较平缓,特别是SHI-1-CD34~+细胞呈缓慢生长趋势。
3.凝胶灰度扫描结果显示bmi-1 mRNA在SHI-1-CD34~+细胞中的表达高于其在脐血-CD34~+与外周血单个核细胞中的表达(P<0.05);bmi-1 mRNA在脐血-CD34~+细胞中低表达或不表达。荧光定量结果表明bmi-1 mRNA/GAPDH mRNA在分选前SHI-1、分选后SHI-1-CD34~+、SHI-1-CD34~-细胞中的表达无显著性差异。
4.重组载体经电泳和测序鉴定,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致。
结论：
1.利用免疫磁珠分选系统成功地分选了白血病细胞株SHI-1细胞中的CD34~+细胞。
2.RT-PCR分析结果显示bmi-1基因在SHI-1-CD34+与SHI-1-CD34-细胞中均高表达,与血液细胞的高增殖能力密切相关。
3.生长曲线结果显示分选后的SHI-1-CD34+细胞增殖不同于分选前SHI-1细胞,不呈指数生长。
4.利用基因克隆技术成功构建了重组逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1。