众所周知,海洋生物圈是一笔巨大的财富,有着来源于海洋植物群和动物群的独特的、有效的生物学活性的天然产物。海洋生物通常在特定的温度、压力、溶解氧和营养可利用性的条件下顽强地生长,因此导致了与陆地生物相比二次代谢产物的生化差异。同样地,来自Blunt等的报道揭露了从2001年到2015年从海洋生物中总共分离到14637种新型的天然产物。海洋微生物被证明可以产生有着极好活性的化合物,如抗菌、抗肿瘤、抗癌性。更具体地说,在先前的研究中,海洋来源的化合物已经显示出抗菌能力,如在日本,从曲霉菌(sp.OPMF00272)中分离到的Terretonin G。更多有用的资料可以从文献中查到。此外,多样性的生物技术方法的使用显著地促进各种药用目的的化合物的产生。海洋生物技术极大地影响着化学产物、酶和药物,例如从宇螺中分离的齐考诺肽(止痛药)、从海绵中分离到的阿糖胞苷(抗癌)或者从水母(又称为维多利亚多管发光水母)中分离的绿色荧光蛋白。此外,海洋真菌已经被揭露有着极好的抗菌特性,从它们的发现到生产已经深入研究。的确,各种化合物正在处于不同的研究阶段,但是,有效天然产物的工业生产不应该被忽视,当然在工业生产中生物技术方法是优先考虑的。由于缺乏有效的资源,包括基金或人力,方法和技术,在过去的几年里,分离到的有效的抗菌化合物不停地减少。此外,由于进化的观点,病原体具有迅速变异的能力,引起遗传物质的改变,导致耐受性。因此,迫切需要创新方法用来分离和阐明有效抗菌特性的新型候选物。根据Shi等(2015),天然产物的产生可以被通过螯合作用生活在重金属应力环境中的微生物增加。基于以前的研究,“代谢转换”假说可以提出与在应力条件下的耐受菌株产生二次代谢产物有关。同样地,新型有效的代谢物的产生可能受到特定的螯合能力、显著的催化作用和微生物中隐藏的生物合成基因簇的启动的影响。我们的研究引入关于中国舟山海岸的海洋沉积物中分离到的海洋真菌的金属压力胁迫的观点。在这个实验中金属压力的方法指的是在青霉菌(sp.BB1122)的培养中使用特定浓度的重金属充当刺激素,极有可能使得隐藏基因簇的开放,因此引起新型二次代谢产物的产生。几种分离得到的新型聚酮化合物的分离和结构阐明被解析,根据抗菌活性筛选出抗葡萄球菌、绿浓杆菌、克雷白氏杆菌的一系列新化合物。在本研究中,钴被选为刺激素来给真菌压力,与正常生长菌株相比较,增强了真菌的抗菌性的表现。为了证明这个假设,对三种病原菌葡萄球菌、绿脓杆菌和克雷白氏杆菌实验,检测钴压力提取物的最小抑菌浓度(MIC)与正常培养的提取物的MIC值相比低很多。此外,基于正常培养组和钴压力培养组的高效液相色谱图的差异,八种代谢物已经成功被分离出来,其中的四种是新型的化合物,四种是已知的化合物。在这篇研究中,我们的重点是关注在半极性的化合物,这些化合物很容易被辨别出来,因为与正常培养组相比新的化合物是新出现的,而且分离度很好。同样地,在高效液相色谱指导的分离中通过应用制备高效液相色谱(C18)对压力代谢物进行分离。钴压力培养被放大并提取分离,应用光谱分析技术,ID、2D核磁共振,高分辨率质谱仪技术,阐明和证实了一种新的黄绿青霉素类似物(1)、一种新的带有一个2,6-二氧杂二环[3,2,1]辛烷环的多烯吡喃酮聚酮化合物(5)、两种新的带有2,5-二氧杂二环[2,2,1]庚烷环的多烯吡喃酮聚酮化合物(7和8)和4种已知的化合物。化合物1是被分离出来是一种微黄色的半固体。通过高分辨率飞行时间质谱仪分析其离子峰在425.1919、403.2102、827.3964 m/z。化合物1的氢谱和碳谱表明了 23个碳原子的相似的化学转换和相同的多样性,这23个碳原子包括一个四氢呋喃环、一个α-吡喃环和一个1,3,5,7-辛四烯,表明化合物1可以推测出有α-吡喃环型的聚酮化合物的基本结构。自然生产的α-吡喃环型的聚酮化合物可以分类为两种主要类型:C24H3407类似物和黄绿青霉素类似物。这两种类型的分子都包含两种确切的结构域:被一条烯烃链连接的α-吡喃环和四氢呋喃环。两种聚酮化合物类似物存在于自然界中,其中C24H3407类似物在大多数结构中被发现了。主要的差异存在于烯烃链,在C24H3407类似物的烯烃链上有3个甲基基团,而在黄绿青霉素类似物的烯烃链上只发现了一个甲基基团。在氢谱中,独特的烯烃质子信号,氢位移5.72(单峰,H-6)、6.37(H-8)、6.35(H-9)、6.59(双峰,J=14.53,11.04Hz,H-10)、6.32(H-11)、7.20(H-12)、6.34(H-13),和甲基质子信号,氢位移在1.94(单峰,H-21),排除了 C24H3407类似物存在的可能性。由于化合物1中缺乏环氧乙烷的亚结构,这个结果被进一步证实。在化合物1的H-H共振中,H8=H9=H10=H11=H12=H13的特征序列减少了 H-9/H-10,H-10/H-11,H-11/H-12,H-12/H-13的交叉峰,表明了黄绿青霉素骨架的存在。为了阐明在假定的黄绿青霉素骨架中三个结构域的连接以及两个羟基、五个甲基、一个羰基和一个含甲氧基集团的位置,进行了明确的2D核磁共振实验。烯烃质子信号,氢位移5.57(单峰,H-17),表明与内酯羰基的碳信号具有长程相关性,碳位移 164.97(C,C-18)、108.51(C,C-15)、171.39(C,C-16),其中烯烃的C-16表明OCH3/C-16的1H的异核多碳相关谱(HMBC)交叉峰,从而定位羰基在α-吡喃环的18号碳,OCH3在α-吡喃环的16号碳上。由于在化合物1的HMBC谱图中,氢位移1.98(单峰,甲基-22)和碳位移154.93(C,C-14)、119.15(CH,C-13)的长程相关性,22号甲基存在于碳15位。甲基-21/C-6和甲基-21/C-7的HMBC交叉峰以及H-6/甲基-21的NOESY交叉峰可以被观察到,展示出甲基-21指定在分子1的烯烃链上的7号碳上。在化合物1的碳谱中可以看到两个氧化的叔碳,碳位移为77.51(CH,C-2)、84.74(CH,C-2),和两个氧化的季碳,碳位移为81.26(C,C-3)、86.50(C,C-5),揭露了高度氧化的四氢呋喃环的存在。观察到从质子信号,氢位移1.19(双峰,J=6.36Hz,甲基-1),到碳共振,碳位移77.51(CH,C-2)、81.26(C,C-3)的长程相关性,从质子共振,氢位移1.20(单峰,甲基-19),到碳信号,碳位移77.51(CH,C-2)、84.74(CH,C-4)的相关性,以及从质子信号,氢位移1.39(单峰,甲基-20),到碳共振,碳位移为84.74(CH,C-4)、86.50(C,C-5)的相关性,可以推断出四氢呋喃环上的三个甲基基团位于2号碳、3号碳和5号碳。在分子式C23H30O6的指导下,在化合物1的碳谱上,C-3和C-4的氧化碳共振特征可以推断出有两个羟基。从交叉峰的HMBC分析中,从氢信号,氢位移6.34(H-13)到碳共振,碳位移为154.93(C,C-14)、108.50(C,C-15)以及从氢信号,氢位移1.98(单峰,甲基-22)到碳信号,碳位移119.15(CH,C-13),可以推论出α-吡喃酮环和烯烃链被C13-C14键连接。从氢信号,氢位移5.72(单峰,H-6)到碳信号,碳位移86.50(C,C-5)的长程相关性证明C5-C6键连接着四氢呋喃环和烯烃链,这在化合物1中C6/C4的NOESY交叉峰中可以证实。从上面的分析中,阐明的平坦结构,和黄绿青霉素相似。NOESY实验的详细的分析证明了 C6=C7双键的空间构型和黄绿青霉素中C6=C7双键的E构型不同。从质子信号,氢位移5.72(单峰,H-6)到质子信号,氢位移1.94(单峰,甲基-21)的特征NOESY相关性表明C6=C7的Z构型,这是大自然中的第一例。C-5的相关构型被证明与已知化合物黄绿青霉素的不同。在化合物1的NOSEY谱图上,质子共振,氢位移1.39(单峰,甲基-20)显示出和质子信号,氢位移3.99(单峰,H-4)有交叉峰,说明了烯烃链的C-5和C-4位的羟基在像β构型一样在同一边,与已知的化合物黄绿青霉素的烯烃链的α型相反。由于观察到甲基-19/H-2的NOESY交叉峰,所以C-3位的羟基和C-2位的甲基在同一边,同时,甲基-19与H-4没有表现出相关性,说明甲基-1是α型,甲基-19是β型。为了进一步确证这个新的结构,进行了化合物1的电喷雾质谱(ESI-MS/MS)实验。化合物1的正离子和负离子模式通过质谱来实现。化合物的阳离子电喷雾质谱在403.2101m/z中提供主要的[M+H]+离子。如图5,在315.1586m/z中,前体离子的碎片可以产生一个有趣的产物离子,这是由于在403.2101中来自前体离子的中性分子C4H802(88道尔顿)的排除。在m/z297.1478和298.1474的产物离子通过失去18和30道尔顿产生的,这两个分子量可以分别合理地推定为H20和CH2O。此外,在m/z 139.0851,可以观察到失去中性的146道尔顿(被认表为C11H14)产生碎片离子。在m/z401.1984中,化合物的负离子电喷雾质谱提供主要的[M-H]-离子。在m/z 300.1371的碎片离子通过失去101道尔顿产生,这和C-3位的羟基残余相一致,C-3位在m/z285.1122中连续失去甲基原子团(15道尔顿)产生一个产物离子。化合物1的绝对构型的确定是通过计算ECD谱来实现的。运行GAUSSIAN 09来优化两种构象异构体的最低能量结构,在气相中以B3LYP/6-31+G水平使用离散傅里叶变换(DFT)。ECD谱的计算被激发通过使用含时密度泛函理论(TDDFT),在甲醇中以B3LYP/6-31+G水平,使用B3LYP功能函数。SpecDis被用来绘制计算出的ECD曲线。计算出的ECD谱可以看到和实验的ECD谱一样,在谱图上,化合物1的绝对构型被确定为2S,3S,4S,5S)。化合物1,一种新型的聚酮化合物,因此被称为新型黄绿青霉素。化合物7:多烯烃αα-吡喃酮型的聚酮化合物毒枝菌素,一组化合物吸引了许多注意,因为它们的新型结构和生物特性,它们的结构上有一个结合吡喃酮系统和一个二氧杂二环[3,2,1]辛烷环部分。两种主要的结构特征可以被分类为黄绿青霉素类似物和金轮霉素类似物。这两种类型唯一的差异存在于第一类黄绿青霉素类似物中2,6-二氧杂二环[3,2,1]辛烷环是连接在乙烷基上,而金轮霉素类似物中则是连接在甲烷基上。金轮霉素已经被广泛地研究,而尽管黄绿青霉素(到目前为止四种天然产生的化合物已经被分离出来了)在1970-1980年期间被分离出来了,但是氢谱和碳谱还没有被确定,并且绝对构型还没有完成。在这篇研究中,三个已知的黄绿青霉素类似物称为黄绿青霉素、epicitreoviridin和epiisocitreoviridin,和一种新型的黄绿青霉素称为10Z isocitreoviridin,被分离为应力代谢物。它们的核磁共振任务和绝对构型第一次被完成了。获得的化合物7是微黄色的半固体。基于高分辨率飞行时间质谱仪在m/z419.2045[M+H]+中的离子峰,化合物7的分子式确定为C23H3007。与化合物1、已知的黄绿青霉素、epicitreoviridin和epiisocitreoviridin相比,化合物7的氢谱和碳谱显示α-吡喃酮部分的7个碳原子的相似的化学转换,说明化合物7是一种α-吡喃酮聚酮化合物。然而,基于化合物7的1D和2D核磁共振数据,化合物7的多烯烃链被证明与黄绿青霉素、金轮霉素和黄绿青霉素类似物的多烯烃链不同。化合物7的氢谱中,独特的质子信号,氢位移5.24(双峰,J=6.85 Hz,H-13)使得它的结构与所有自然生产的黄绿青霉素、金轮霉素和黄绿青霉素类似物不同,它们的烯烃链是直接连接在α-吡喃酮单元上的。C-13上的羟基集团的亚结构能使多烯链迁移。为了确定多烯的迁移,进行了详细的2D核磁共振实验。分子7的烯烃链是通过一个氧化的碳原子连接到α-吡喃酮环上的,这是通过C8-C9=C10-C11=C12-CO的H-H COSY序列以及从质子信号,氢位移5.24(双峰,J=6.85Hz,H-13)到多烯链上的烯烃碳信号,碳位移131.54(CH,C-12)和α-吡喃酮环上的烯烃碳信号,碳位移160.41(C,C-14)的远程相关性证实的。这是第一例α-吡喃酮聚酮化合物上的多烯迁移现象。因为双键的迁移,2,6-二氧杂二环[3,2,1]辛烷环系统被重新排列。通过HMBC和NOESY谱的分析,化合物7的多烯链的另外一边的的环系统的重新排列被确定了。既然一个双键迁移到C-7上,通过氧连接到C-7上的辛烷环在氧原子和C-7的连接上被打开。尽管辛烷环被打开了,从质子信号,氢位移3.70(单峰,H-4)到质子信号,氢位移1.78(单峰,甲基-21)和烯烃质子信号,氢位移6.18(双峰,J=11.39Hz,H-8)的NOSEY相关性说明了它们之间是关闭的。因此,假定辛烷环是浓缩的,通过分子式C23H30O7的分析可以证实。在开放的辛烷环,有两个氧化的碳原子称为C-4和C-6,有可能和氧化的C-3使环缩合。然而,由于质子共振,氢位移3.70(单峰,H-4)到质子共振,氢位移6.18(双峰,J=11.39Hz,H-8)以及质子共振,氢位移3.70(单峰,H-4)到质子共振,氢位移1.78(单峰,甲基-21)的NOSEY交叉峰,C-4位的C-O键的排列方向被证明是指向C3-O键的反面。这个推论排除了环在C-3和C-4之间被氧原子桥重排的可能性,使得只有一种可能性,重排2,6-二氧杂二环[3,2,1]辛烷环变成2,5-二氧杂二环[2,2,1]庚烷,在C6和C3之间的氧原子连接。从上面发表的数据可以看出,化合物7被指定为有一个多烯聚酮化合物,带有被一个迁移的多烯链连接的一个2,5-二氧杂二环[2,2,1]庚烷环和一个α-吡喃酮环。这三个结构域通过详细的2D核磁共振数据的分析被构建结构。从甲基-21/C-6,H-6/H-7和H-6/H8的特征交叉峰,可以推论出多烯链通过C6-C7连接在庚烷环上。从甲基质子信号,氢位移1.78(单峰,甲基-21)到碳信号,碳位移128.70(CH,C-8)的长程相关性,说明和其它青霉素一样,甲基-21基C-7位上。三个甲基基团甲基-1,甲基-19,甲基-20被分布被定位在2,5-二氧杂二环[2,2,1]庚烷环的C2,C3,C5上,这是从甲基-1/C-2,甲基-19/C3和甲基-20/C-5的HMBC交叉峰推断出来的。基于从质子信号,氢位移3.70(单峰,H-4)到碳信号,碳位移85.19(C,C-3)的长程相关性,羟基基团是位于C-4上。从多烯链上的质子信号,氢位移5.91(dd,J=15,.10,6.83 Hz,H-12)和质子共振,氢位移5.24(双峰,J=6.85Hz,H-13)到烯烃碳信号,碳位移为160.41(C,C-14)的长程相关性通过羟基所在的氧化的C-3连接多烯链到α-吡喃酮环上。从上面的分析,化合物7,作为一个新的多烯烃吡喃酮聚酮化合物,其平坦结构被阐明(如图7)。通过NOSEY实验,化合物7的相关构象被确定。由于观察到H-4/甲基-21和H-4/H-8的NOSEY交叉峰,多烯链被指定为β型。这也说明C-4位的羟基基团被定向如图8,这是通过H-4/甲基-19和H-4/甲基-20的NOSEY交叉峰的观察确证的。基于从质子信号,氢位移1.25(H-2)到质子信号,氢位移1.27(单峰,H-19)的NOESY相关性,与已知的2,6-二氧杂二环[3,2,1]辛烷聚酮化合物一样,甲基-1被指定为α型。因此,聚酮化合物7俗称为penicillstressol。用相同的方法我们分离鉴定了新化合物8,命名为eisopenicillstressol,新化合物5,命名为10Z-isocitreoviridinol。同时,我们还分离鉴定了已知化合物epiisocitreoviridinol(4),citreoviridinol(6),epicitreoviridinol(3)和citreoviridin(2),并对其中的epiisocitreoviridinol(4)和citreoviridinol(6),epicitreoviridinol(3)的绝对构型进行确定。Epiisocitreoviridinol(4),citreoviridinol(6),epicitreoviridinol(3)分别为2S,3R,4S,5R,6R,7R和2R,3S,4R,5S,6S,7R和2R,3S,4R,5S,6R,7R。我们研究了化合物的抗菌活性,结果是令人振奋的。新化合物7,8和5显示非常良好的活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)MIC=0.5μg/mL和1μg/mL。化合物1,7和8针对绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa显示良好的抗菌活性MIC=4μg/mL。