研究背景胶质瘤(glioma)是最常见的恶性颅内原发肿瘤,占颅内原发肿瘤的60%以上。由于其侵袭性强,且边界不清,所以很难单纯手术将其完全切除。尽管目前在胶质瘤诊断方法和治疗策略上都取得了长足的发展,但胶质瘤致死率仍居高不下,患者的5年生存率依然很低。目前对于脑胶质瘤发病的病理生理机制尚不完全清楚,很多胶质瘤的替代治疗方法的研究仍在进行中。因此,进一步阐明胶质瘤发生及发展的分子机制,将有助于胶质瘤的早期准确诊断、及时干预和制定有效的治疗策略。中心体是人体细胞主要微管组织中心,在胞质分裂中主要参与细胞极性和染色质正常分离,可参与纺锤体形成,确保子细胞遗传信息准确分配。因此,中心体的结构、功能和数量在细胞内受到严格的控制。中心体的结构、功能或者数量异常均可导致染色体错误分离,从而导致非整倍体的出现,染色体不稳定以及胞质分裂失败。这些均可引起基因组不稳定,从而介导肿瘤的发生。最近研究发现中心体数量异常与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关。中心体蛋白55(Centrosome protein 55,CEP55)是中心体相关蛋白家族中最新发现的一种高度卷曲的螺旋蛋白,可参与细胞分裂调控,在细胞周期进展过程中发挥重要作用。当其表达异常时,可导致胞质分裂功能失调,多极纺锤体以及非整倍体细胞出现,继而会引起染色体状态不稳定,导致肿瘤的发生和发展。大量研究发现,CEP55在人多种肿瘤细胞和组织中表达上调,并且其表达水平和患者的临床病理特征以及预后关系密切。CEP55在肿瘤细胞和组织中表达的普遍性和广泛性,说明其在肿瘤发生及发展过程中发挥重要的生物学功能。至于其在胶质瘤中的表达水平、预后价值以及其在胶质瘤细胞恶性表型发展中的生物学功能尚不完全清楚。揭示CEP55在胶质瘤发生发展过程中的可能作用机制,为进一步研究胶质瘤的潜在治疗方法和精确诊断提供重要的参考价值。真核生物基因的表达受多个方面的调控,其中基因的转录环节的调控对基因的表达意义重大。转录过程中转录因子可通过和特定的结合位点结合,从而开始特定基因的转录表达。目前发现的人基因组中的转录因子已有2000多个,这些转录因子调控着人类许多基因的表达,构成了极其复杂的基因转录调控网络,对于身体正常的生理活动意义重大。目前对于转录因子在调控肿瘤相关基因表达的研究日益增多,一些转录因子的失调可能导致正常细胞获得肿瘤相关特性。因此,关于转录因子在肿瘤中的差异性表达以及相关调控基因的研究,对于理清肿瘤的发生发展机制以及发掘可能有效治疗靶点,提供重要的依据。FOXM1属于叉头框家族中的一员,是参与调节正常细胞增殖相关的转录因子。另外,大量研究发现,FOXM1在多种肿瘤组织和细胞中表达上调,并且可调控不同癌基因表达,在肿瘤的发生发展过程中发挥不同的生物学功能,并且可作为肿瘤的潜在标记物和治疗靶点。在胶质瘤中,FOXM1表达上调,并且可促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学功能,但是其具体作用机制目前尚不完全了解。在本研究中,我们通过检测CEP55在胶质瘤组织中的表达差异,探究其与临床患者病理特征之间的关系以及对患者预后的指导意义。然后分析FOXM1和CEP55在胶质瘤中表达的相关性,以及探讨两者在胶质瘤发展过程中可能的作用机制。本研究将分为以下三个部分进行阐述。第一部分 CEP55在人胶质瘤组织中表达及其预后意义研究目的1.研究CEP55 mRNA和蛋白在胶质瘤组织中的表达情况;2.分析CEP55蛋白表达水平和胶质瘤患者临床病理特征之间的关系以及对患者预后指导意义。材料和方法1.通过qRT-PCR和western blot方法检测胶质瘤组织以及正常脑组织标本中CEP55 mRNA以及蛋白表达水平;2.通过免疫组织化学方法检测CEP55蛋白在胶质瘤组织芯片中的表达情况,并分别进行免疫组化评分,根据评分结果将患者进行分组;3.根据分组结果,χ2检验统计分析CEP55蛋白的表达水平和胶质瘤患者临床病理之间的关系,Log-rank检验CEP55表达水平对胶质瘤患者总生存期和无进展生存的影响。Cox回归分析判断临床病理特征以及CEP55蛋白表达水平和患者临床预后的关系。结果1.CEP55在胶质瘤组织中表达量上调通过对53例人脑胶质瘤和5例人脑正常组织进行qRT-PCR和western blot检测,CEP55 mRNA和蛋白在胶质瘤组织中表达较正常脑组织表达明显上调,而且,随着肿瘤级别增加,表达水平也随着增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.CEP55表达水平和临床病理特征之间的以及患者预后的关系我们通过免疫组织化学方法检测胶质瘤组织芯片中CEP55的表达情况并根据染色结果进行分组,临床病理资料分析结果表明CEP55表达水平和患者WHO分级(P<0.0001)以及是否复发(P<0.0001)关系密切,但是和患者年龄、性别和肿瘤发生部位无明显相关性(P>0.05)。Log-rank检验结果显示,CEP55高表达患者的总生存期和无进展生存期均降低(P<0.0001)。Cox回归分析发现CEP55蛋白的表达水平是影响胶质瘤患者总生存期(P=0.001)和无进展生存期(P=0.011)的独立预后因素。结论1.CEP55在胶质瘤组织中表达较正常脑组织中表达上调;2.CEP55蛋白表达水平和胶质瘤的病理分级密切相关;3.CEP55表达上调和胶质瘤患者预后不良相关。第二部分 CEP55在胶质瘤中发挥的生物学功能研究研究目的探究CEP55在胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移、凋亡以及自噬等生物学过程中的作用。材料和方法1.通过qRT-PCR和western blot方法检测CEP55 mRNA和蛋白在四种胶质瘤细胞系(U87、U251、SW1783和HS683)中的表达情况,选择CEP55表达水平较高的细胞用于干扰实验,表达水平较低的用于过表达实验;2.构建合成CEP55干扰和过表达慢病毒,然后分别转染胶质瘤细胞系,并筛选出稳定转染细胞,用于后续功能验证;3.通过CCK-8以及EdU细胞染色方法检测CEP55对胶质瘤细胞增殖能力的影响;通过Transwell小室实验检测CEP55对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响;western blot检测CEP55表达变化后,上皮-间充质转化标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和 Snail)的表达变化;4.通过Annexin V-FITC/PI双染法检测CEP55对于胶质瘤细胞凋亡的影响,western blot 检测 CEP55 表达变化后,Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-parp 1等凋亡相关蛋白的表达变化;5.通过透射电镜检测CEP55表达下调后自噬小体的形成,western blot检测自噬调节分子LC3B、Beclin 1和P62表达变化,然后通过mRFP-GFP-LC3双标腺病毒来检测自噬小体和自噬溶酶体的形成情况。结果1.CEP55在人脑胶质瘤细胞系中的表达情况及转染效率验证qRT-PCR 和 western blot 结果显示 CET55 在 U87、U251、SW1783 和 HS683四种胶质瘤细胞系中均表达,而且其mRNA和蛋白在U87和U251两种细胞系中表达水平较高,而在SW1783和HS683两种细胞系中表达水平较低;U87和U251通过转染干扰慢病毒后,可显著降低CEP55 mRNA和蛋白表达水平,并且SW1783和HS683转染过表达慢病毒后,可显著增加CEP55 mRNA和蛋白表达水平,并成功筛选出稳定干扰和过表达细胞,用于后续功能验证。2.CEP55可促进胶质瘤细胞增殖能力CCK-8实验结果表明U87和U251细胞沉默CEP55表达连续培养3天后,增殖能力及细胞活力较Scramble组均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);相反,上调CEP55的表达后,HS683和SW1783细胞连续培养3天后,增殖能力及细胞活力较Vector组均增高,差异具有统计学意义(P<0.05);EdU细胞染色方法结果显示沉默CEP55表达后,U87和U251细胞中EdU阳性细胞比例明显较Scramble组降低;而过表达CEP55的HS683和SW1782细胞中EdU阳性细胞比例明显较Vector组增高。3.CEP55可促进胶质瘤细胞上皮-间充质转化,并且促进侵袭和迁移能力Western blot检测结果表明U87和U251细胞干扰CEP55表达后,N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达降低,而E-cadherin蛋白表达增高;相反,HS683和SW1783细胞过表达CEP55之后,E-cadherin蛋白表达降低,而N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达增高;Transwell小室结果显示U87和U251细胞沉默CEP55以后,Transwell侵袭和迁移实验下室细胞较Scramble组明显减少(P<0.01);而HS683和SW1783细胞过表达CEP55之后,Transwell侵袭和迁移实验下室细胞较Vector组明显增多(P<0.01)。4.下调CEP55可促进胶质瘤细胞凋亡Annexin V-FITC/PI双染法结果显示U87和U251细胞干扰CEP55表达之后,sh-CEP55组凋亡比例细胞较Scramble组明显增高;Western blot检测凋亡相关蛋白,结果显示,sh-CEP55 组 cleaved-caspase 9、cleaved-parp 1 以及 Bax 蛋白较Scramble组表达增高,而Bcl-2蛋白较Scramble组表达降低。5.下调CEP55可促进胶质瘤细胞发生自噬透射电镜检查结果发现胶质瘤细胞U87和U251细胞干扰CEP55表达之后,可见大量自噬小体形成;western blot检测结果表明干扰CEP55表达后,LC3、Beclin 1蛋白表达增加,而P62蛋白表达降低;mRFP-GFP-LC3双标腺病毒检测结果表明干扰CEP55表达后,肿瘤细胞自噬小体和自噬溶酶体数量明显增加。结论1.CEP55可促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力;2.下调CEP55的表达可促进胶质瘤细胞凋亡;3.下调CEP55的表达可促进胶质瘤细胞自噬发生。第三部分 FOXM1调控CEP55表达促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移研究目的1.探究胶质瘤中FOXM1和CEP55表达之间的关系;2.探究FOXM1调控CEP55表达促进胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的作用机制。材料和方法1.通过生物信息学技术分析TCGA和GTEx数据库中胶质瘤组织和正常脑组织中FOXM1和CEP55两个基因的表达情况,并且进行相关性分析;然后分别分析其表达水平对于胶质瘤患者总生存期的影响;2.qRT-PCR检测胶质瘤组织中FOXM1 mRNA表达情况,并分析其与CEP55 mRNA表达之间的关系;3.构建合成FOXM1干扰和过表达慢病毒,然后分别转染胶质瘤细胞系,并筛选出稳定转染细胞,用于后续实验;4.qRT-PCR和western blot检测胶质瘤细胞系干扰或者过表达FOXM1后,CEP55 mRNA和蛋白表达变化;5.双荧光素酶实验验证CEP55是否为转录因子FOXM1的靶基因;6.CCK-8、平板克隆形成实验、EdU细胞染色、Transwell小室、以及western blot检测FOXM1调控CEP55表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭以及迁移能力的影响;7.裸鼠颅内成瘤实验验证FOXM1/CEP55对胶质瘤生长调节的作用。结果1.FOXM1和CEP55在胶质瘤组织中高表达,并且两者表达成正相关生物信息学技术分析结果显示FOXM1和CEP55 mRNA在胶质瘤患者中的表达水平较正常脑组织中显著上调,而且在GBM中的表达水平高于LGG患者,且两者表达具有显著相关性(r=0.78,P<0.0001);qRT-PCR检测结果显示FOXM1 mRNA在胶质瘤组织中表达较正常脑组织表达明显上调,而且,随着肿瘤级别增加,表达水平也随着增加,通过和CEP55 mRNA表达水平进行统计分析,结果发现两者表达具有明显相关性(r=0.82,P<0.0001)。2.FOXM1和CEP55高表达预示胶质瘤患者预后不良Kaplan-Meier生存曲线显示,在LGG患者中,CEP55和FOXM1表达水平和患者的总生存时间显著相关(P=0.0012,P=0.0035);虽然在GBM中高表达患者和低表达患者总生存时间没有显著性差异(P=0.069,P=0.18),但CEP55和FOXM1表达水平较低的患者比表达水平较高的患者有更长的总生存时间;而在总体胶质瘤患者中,CEP55和FOXM1表达水平和患者的总生存时间显著相关(P<0.0001,P<0.0001)。3.CEP55是转录因子FOXM1的下游靶基因,并且FOXM1可促进其转录表达qRT-PCR和western blot检测结果显示U87和U251细胞干扰FOXM1表达后,其CEP55 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);而HS683和SW1783细胞过表达FOXM1后,CEP55 mRNA和蛋白表达水平均显著提高(P<0.01);双荧光素酶报告基因实验检测发现FOXM1能显著上调含有CEP55野生型启动子的luciferase表达(P<0.05),当突变其结合位点后,荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。4.上调CEP55表达可以降低干扰FOXM1对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用在干扰FOXM1表达的胶质瘤细胞系中,通过转染CEP55过表达慢病毒,通过CCK-8、平板克隆形成实验以及EdU细胞染色检测结果显示下调FOXM1对胶质瘤细胞增殖抑制作用可被CEP55逆转;同样,Transwell小室和western blot实验结果显示CEP55可以部分恢复FOXM1下调对于胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。5.上调CEP55表达可逆转FOXM1下调对胶质瘤成瘤能力和生存率的抑制作用为了证实FOXM1/CEP55是否参与调控胶质瘤细胞的体内致瘤性,我们在裸鼠脑内立体定向注射了稳定表达sh-FOXM1+Vector或sh-FOXM1+CEP55的U87细胞。我们观察到当沉默FOXM1表达时,荷瘤小鼠的肿瘤形成体积显著减少,小鼠的生物学状态良好和生存率增加,但CEP55的过度表达逆转了这个现象。这些数据表明,CEP55是FOXM1促进胶质瘤细胞成瘤潜能的关键靶点,FOXM1/CEP55轴在体内促进了肿瘤的进展。结论1.FOXM1和CEP55在胶质瘤中表达上调,两者表达成正相关,并且和患者不良预后相关;2.CEP55是FOXM1下游靶基因,并且FOXM1可通过与CEP55启动子区结合,调控CEP55的表达;3.FOXM1对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响部分依赖于CEP55的表达。