第一部分大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的听力损失实验目的:我们利用C57小鼠腹腔注射顺铂制造药物性听力损失模型,用顺铂联合大蒜素腹腔注射来探讨大蒜素在体内对顺铂诱导的听力损失是否具有保护作用。实验方法:体内实验所用C57小鼠性别匹配,年龄在7-8周,体重17-23 g。小鼠被随机分为三组,每组30只;第1组,0.9%生理盐水注射为对照组;第2组,顺铂注射;第3组,顺铂+大蒜素注射。第1组小鼠给予连续七天腹腔注射0.9%生理盐水(0.6毫升/100克)。第2组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂(3毫克/公斤)。第3组小鼠在顺铂注射前一天腹腔注射大蒜素(18.2毫克/公斤),在接下来的连续七天先腹腔注射大蒜素,2小时之后再腹腔注射顺铂(3毫克/公斤),用药前和用药后检测三组小鼠的听性脑干反应(ABR),TUNEL凋亡试剂盒检测三组小鼠耳蜗外毛细胞、支持细胞和螺旋神经节神经元的凋亡情况。对三组小鼠耳蜗中剩余的外毛细胞和螺旋神经节神经元进行计数,用透射电镜观察外毛细胞和螺旋神经节神经元中线粒体情况,用Western blot检测三组耳蜗组织中 Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3 的表达情况,免疫荧光检测三组小鼠耳蜗外毛细胞中P53的表达和螺旋神经节神经元中细胞色素-C、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表达情况,检测三组小鼠耳蜗组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。实验结果:ABR结果表明,C57小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出听觉脑干反应的阈值增加,而大蒜索+顺铂组小鼠的听觉功能的大部分频率受到保护。顺铂引起耳蜗外毛细胞及底转、中转的螺旋神经节神经元计数减少,大蒜素能保护顺铂引起的耳蜗外毛细胞及耳蜗中转的螺旋神经节神经元损伤。TUNEL检测结果显示:顺铂引起耳蜗外毛细胞、支持细胞及耳蜗底转和中转螺旋神经节神经元凋亡,大蒜素能明显地减少顺铂诱导的凋亡情况。透射电镜结果显示:大蒜素能显著地降少顺铂诱导的螺旋神经节神经元中线粒体的损伤。Western blot结果显示:顺铂增加耳蜗组织中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表达,降低Bcl-2的表达;大蒜素能显著地降低耳蜗组织中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表达,增加Bcl-2的表达。免疫荧光结果显示:顺铂诱导螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表达增强,诱导外毛细胞、支持细胞中P53的表达增强,大蒜素能显著地减少螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放,cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表达,减少耳蜗中转、底转外毛细胞中P53的表达及耳蜗中转支持细胞中P53的表达。此外,大蒜素能降低耳蜗组织中丙二醛水平,升高耳蜗组织中超氧化物歧化酶的水平。实验结论:大蒜素可有效地预防顺铂诱导的听力损失,其中大蒜素通过线粒体途径保护顺铂诱导的螺旋神经节神经元的凋亡,通过p53途径来保护耳蜗外毛细胞和支持细胞的凋亡。同时大蒜素通过抗氧化作用保护顺铂诱导的耳蜗损伤。第二部分大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的前庭毒性实验目的:本研究的目的是探讨大蒜素对顺铂诱导的小鼠前庭功能障碍的保护,并探讨大蒜素对顺铂诱导的耳前庭毒性的保护作用机理。实验方法:本实验所用C57小鼠性别匹配,年龄在7-8周,体重17-23 g。小鼠被随机分为三组,每组10只;第1组,0.9%生理盐水注射为对照组;第2组,顺铂注射;第3组,顺铂+大蒜素注射。第1组小鼠给予连续七天腹腔注射0.9%生理盐水(0.6毫升/100克)。第2组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂(3毫克/公斤)。第3组小鼠在顺铂注射前一天腹腔注射大蒜素(18.2毫克/公斤),在接下来的连续七天先腹腔注射大蒜素,2小时之后再腹腔注射顺铂(3毫克/公斤),用药前后都用游泳实验来观察小鼠的泳姿情况。游泳测试设备为盛有温水的矩形水箱,长70厘米,宽40厘米,深10厘米,小鼠被放置在水箱的中心和身体与水箱的长轴平行,放手,观察小鼠自由游泳的姿势。小鼠以稳定的姿势游泳,头露出水面,评分为3分。小鼠头露出水面,游泳姿势不稳,评分为2分。小鼠的头部不能向上或不能露出水面,评分为0分,这只小鼠必须立即从水中被救出,以免被淹死。每组随机抽取5只小鼠进行游泳试验,每只小鼠进行3次试验,每次1分钟,每次间隔10分钟。交替试验,防止过度疲劳影响试验结果。计算游泳得分平均数进行统计分析。测试是在室温下进行的。用免疫荧光方法观察三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞纤毛束的外观和密度。用TUNEL试剂盒检测三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞的凋亡情况。用免疫荧光方法检测三组中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞质中cleaved-caspase-3的表达情况及荧光密度,用免疫荧光方法检测三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞核中AIF的表达情况及AIF核转移率。实验结果:游泳实验结果表明,C57小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出前庭功能受损,而大蒜素+顺铂组中大蒜素能显著地保护小鼠的前庭功能。注射顺铂7天后,顺铂组的椭圆囊、球囊和壶腹毛细胞的纤毛束数量明显减少,纤毛束分布不均和外观不正常,然而,顺铂+大蒜素组椭圆囊、球囊和壶腹毛细胞的纤毛束保存较好、外观正常和高密度分布。TUNEL检测凋亡情况:对照组没有发现TUNEL染色,在顺铂组的前庭神经节神经元、间质细胞、椭圆囊、球囊、壶腹中毛细胞和支持细胞中发现了 TUNEL阳性染色。然而,在顺铂+大蒜素治疗组的前庭神经节神经元、毛细胞和支持细胞中都没有发现TUNEL染色,只有一些间质细胞被TUNEL染色标记。免疫荧光检测cleaved-caspase-3结果:在对照组中,没有发现cleaved-caspase-3染色。在顺铂治疗组中前庭毛细胞层和血管层细胞的细胞质中发现cleaved-caspase-3阳性染色。在顺铂+大蒜素组中,前庭毛细胞和血管层细胞的细胞质中cleaved-caspase-3的表达明显减少。在顺铂组的前庭毛细胞层和血管层细胞cleaved-caspase-3的荧光密度明显高于对照组,而在顺铂+大蒜素组,大蒜素显著地降低了前庭毛细胞层和血管层细胞cleaved-caspase-3的荧光密度。免疫荧光检测AIF的表达情况:在对照组中,AIF在前庭毛细胞层和血管层细胞质中分布,在细胞核内没有分布。经过7天的顺铂治疗,在前庭毛细胞层和血管层细胞的核区域内发现了强烈的AIF荧光。前庭毛细胞层和血管层细胞中AIF核转移率在顺铂组明显高于对照组;在顺铂+大蒜素组,大蒜素显著地降低毛细胞层AIF核转移率,但是大蒜素没有显著地降低血管层细胞AIF核转移率。实验结论:腹腔注射顺铂的小鼠,在游泳测试中表现出前庭功能障碍,这结果表明小鼠的前庭受损。然而,在大蒜素预处理组,大蒜素可以明显地阻止了这些损伤。大蒜素显著地减少顺铂诱导的椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层和血管层细胞中cleaved-caspase-3的表达,也减少了椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层中AIF的核转位。这些结果表明,大蒜素通过有效地抑制caspase依赖和非caspase依赖的凋亡途径来保护顺铂诱导的前庭功能障碍。因此,大蒜素可能有助于防止顺铂诱导的前庭毒性。