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目的构建上调表达吲哚胺2,3-双加氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）的低免疫原性表皮干细胞,在体外共培养体系验证其对同种异体CD4+T细胞的免疫抑制作用。在体内研究低免疫原性表皮干细胞移植治疗同种异体小鼠创面后,创面愈合情况及低免疫原性表皮干细胞诱导的对自身的免疫保护作用,为临床开发应用低免疫原性表皮干细胞提供新思路。方法一、低免疫原性表皮干细胞的构建（一）过表达IDO表皮干细胞的构建1、IDO基因慢病毒载体构建通过Gen Bank中检索IDO基因序列,根据此序列设计并合成IDO基因产物,扩增IDO基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-Puromycin中,构建慢病毒载体表达质粒。采用聚合酶链反应方法对阳性克隆进行测序分析。将重组过表达病毒质粒及其2种辅助包装原件载体质粒P Helper 1.0、P Helper 2.0共转染293 T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定病毒滴度。2、病毒载体转染表皮干细胞（1）最佳病毒感染复数的测定:将携带EGFP的慢病毒以不同的感染复数（MOI值分别为0,10,20,30,50,80）转染表皮干细胞。转染后72 h,倒置相差显微镜下观察细胞的形态和活细胞数,倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表达,流式细胞仪检测转染率,确定最佳的感染复数。（2）将C57BL/6源小鼠表皮干细胞按随机数字表法分为空白组（Con）,空载组（NC）和IDO过表达组（IDO）。NC组和IDO组分别使用携带EGFP的慢病毒载体和携带IDO基因的慢病毒载体以最佳MOI感染表皮干细胞72 h后,荧光显微镜下观察细胞形态变化和荧光蛋白表达水平。（3）嘌呤霉素抗性筛选获得稳转株:NC组和IDO组表皮干细胞培养基中加入终浓度为1μg/ml的嘌呤霉素进行抗性筛选。培养一周后,q RT-PCR检测各组IDO m RNA的表达水平变化。经蛋白质印记法检测IDO蛋白表达水平变化。（4）1-甲基色氨酸（1-Methyl-D-try Ptophan,1-MT）对IDO表达的抑制作用:将小鼠表皮干细胞分为空白组（Con）,空载组（NC）,IDO过表达组（IDO）和IDO过表达+IDO抑制剂组（1-MT）。经蛋白质印迹法验证1-MT对IDO表达水平的影响。3、转染后表皮干细胞的表型检测（1）细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测表皮干细胞增殖能力变化:将细胞分为Con组、NC组、IDO组、1-MT组,细胞孵箱中培养24 h后,加入CCK-8,2 h后检测细胞吸光度值。（2）Transwell实验检测表皮干细胞迁移能力变化:将细胞分为Con组、NC组、IDO组、1-MT组,分别接种于Transwell上室,细胞孵箱中培养48 h后,固定染色,显微镜下观察下室每视野细胞数量。4、蛋白质印迹法检测转染后表皮干细胞细胞干性标志物整合素β1（Integrinβ1）和角蛋白19（Cytokeratin 19,K19）表达水平变化,检测丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein kinase,MAPK）和蛋白激酶B（Protein Kinase B,Akt）的表达水平和磷酸化水平变化。5、IDO酶活性检测:将细胞分为Con组、NC组、IDO组、1-MT组,利用IDO酶活性检测试剂盒检测各组细胞的IDO酶蛋白的活性。（二）过表达IDO的表皮干细胞具有低免疫原性的实验研究1、从BALB/c小鼠脾脏中提取CD4+T细胞,将其与上述各组表皮干细胞共培养72 h。2、CCK-8法检测共培养体系中CD4+T细胞增殖水平变化。3、流式细胞仪检测共培养体系中CD4+T细胞凋亡情况和调节性T细胞（Treg）的生成情况。4、酶联免疫吸附法（ELISA）检测共培养体系中转化生长因子-β（TGF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-10（IL-10）和白介素-2（IL-2）表达水平的变化。二、低免疫原性表皮干细胞移植修复创面的实验研究1、取健康雄性BALB/c小鼠40只,体质量18 g-20 g,按照随机数字表法分为对照组（NC组）、IDO组、1-MT组、PBS组。2、用皮肤打孔器在小鼠背部制作圆形全层皮肤缺损创面（直径d=10 mm）。伤后第1天,按照分组分别给予不同治疗,NC组:移植100μl转染携带EGFP基因的表皮干细胞悬液（1×107个/ml）,IDO组:移植100μl转染携带IDO基因的表皮干细胞悬液（1×107个/ml）,1-MT组:移植100μl转染携带IDO基因的表皮干细胞悬液（1×107个/ml）,创面每天给予100μl浓度为1 m M的1-MT,PBS组:移植100μl PBS溶液。于第0、5、7天分别拍照并计算创面愈合率。3、于第5、7天每组分别处死5只小鼠。沿伤口边缘向下切除至浅筋膜获得创面样本。免疫荧光观察皮肤创面组织样本中IDO、CD4（CD4+T细胞的标记蛋白）及Fox P3（Treg细胞的标记蛋白）的表达情况。IDO酶活性试剂盒检测皮肤创面组织样本中IDO的酶活性。4、采用Prism（版本号:8.0）软件对数据进行统计分析。文中数据皆为定量数据。所有数据以均数±标准差（（?）±s）表示,多组间均数比较采用单因素方差分析和Tukey-Post-hoc检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果一、低免疫原性表皮干细胞的构建（一）过表达IDO表皮干细胞的构建1、IDO基因慢病毒载体构建:成功扩增IDO基因片段,测序结果显示,过表达慢病毒IDO与Gen Bank中IDO基因序列完全一致,病毒滴度为1×109TU/L。2、慢病毒载体转染表皮干细胞（1）最佳病毒感染复数测定:转染后72h,MOI=10、20、30、50、80组的细胞,细胞形态无明显变化,均呈梭形状,胞体透亮,胞核居中较大。转染组表皮干细胞计数MOI=10（282.7±16.8）明显高于MOI=20（261.7±7.371）、MOI=30（218.7±18.88）、MOI=50（217±30.2）、MOI=80（200.7±33.53）（P＜0.05）,与未转染组MOI=0（300.7±25.38）无统计学差异（P＞0.05）。转染72h,MOI=10、20、30、50、80组表皮干细胞转染率无明显差异（F=95.1,P＞0.05）。（2）转染后镜下观察细胞形态及荧光蛋白的表达:转染72 h后,经倒置相差显微镜观察发现,相较于Con组,NC组和IDO组细胞形态无明显变化,未观察到细胞核形态异常。荧光显微镜下观察发现,Con组无荧光表达,转染慢病毒载体的NC组和IDO组可见绿色荧光表达。（3）转染后表皮干细胞表达IDO m RNA和IDO蛋白水平的检测:qRT-PCR检测IDO m RNA表达水平发现,同Con组（1.034±0.151）相比,NC组（0.124±0.005）表达无明显变化（P＞0.05）,IDO组表达增多至（372.9±18.25）（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测IDO蛋白表达水平发现,Con组和NC组几乎不表达（P＞0.05）,IDO组（1.409±0.023）可见表达明显增多（P＜0.05）。（4）1-MT对IDO表达的抑制作用:蛋白质印迹法验证1-MT对IDO蛋白表达的抑制作用发现,与IDO组（1.409±0.023）相比,1-MT组（0.637±0.039）IDO蛋白表达明显降低（P＜0.05）。3、转染后表皮干细胞的表型检测（1）转染后表皮干细胞增殖能力的变化:CCK-8法检测发现,四组比较无统计学差异（F=17.53,P＞0.05）。在24 h,同Con组（0.75±0.03）相比,NC组（0.65±0.03）和IDO组（0.84±0.02）吸光度无明显变化（P＞0.05）;相较于IDO组,1-MT组（0.61±0.03）吸光度无明显变化（P＞0.05）。（2）转染后表皮干细胞迁移能力的变化:Transwell法检测发现,四组比较无统计学差异（F=7.235,P＞0.05）。同Con组相比（114.3±6.064个/视野）,NC组（121.3±1.667个/视野）和IDO组（125.3±3.480个/视野）细胞迁移无明显变化（P＞0.05）;同IDO组（125.3±3.480个/视野）相比,1-MT组（126.3±3.844个/视野）细胞迁移无明显变化（P＞0.05）。4、蛋白质印迹法检测Integrinβ1发现,四组比较有统计学差异（F=41.99,P＜0.05）。同Con组（0.817±0.045）相比,NC组（1.016±0.023）无明显变化（P＞0.05）,IDO组（1.201±0.045）表达明显增高（P＜0.05）;同IDO组（1.201±0.045）相比,1-MT组（0.671±0.022）明显降低（P＜0.05）。经蛋白质印迹法检测K19发现,同Con组相比（0.567±0.021）,NC组（0.524±0.041）和IDO组（0.563±0.037）无明显变化（P＞0.05）;同IDO组（0.563±0.037）相比,1-MT组（0.432±0.022）表达水平无明显差异（F=41.99,P＞0.05）。经蛋白质印迹法检测P-MAPK/MAPK发现,四组比较有统计学差异（F=89.47,P＜0.05）。同Con组（0.470±0.0458）相比,NC组（0.650±0.065）无明显变化（P＞0.05）,IDO组（1.480±0.027）表达水平明显增高（P＜0.05）;同IDO组（1.480±0.027）相比,1-MT组（0.860±0.041）表达水平明显降低（P＜0.05）。经蛋白质印迹法检测p-Akt/Akt发现,四组比较有统计学差异（F=19.41,P＜0.05）。同Con组（0.900±0.046）相比,NC组（0.970±0.009）无明显变化（P＞0.05）,IDO组（0.568±0.018）表达明显降低（P＜0.05）;同IDO组（0.568±0.018）相比,1-MT组（0.874±0.064）表达水平明显增高（P＜0.05）。5、IDO酶活性检测:IDO酶活性检测试剂盒检测发现,四组比较有统计学差异（F=150.2,P＜0.05）。经IDO酶活性检测试剂盒检测发现,同Con组（15.12±1.105U/g）相比,NC组（15.36±1.10 U/g）酶活性无明显变化（P＞0.05）,IDO组（56.76±4.33 U/g）酶活性明显增高（P＜0.05）;同IDO组（56.76±4.33 U/g）相比,1-MT组（19.06±3.381 U/g）酶活性明显降低（P＜0.05）。（二）过表达IDO的表皮干细胞具有低免疫原性的实验研究1、CCK-8法检测共培养体系中CD4+T细胞增殖水平发现,四组比较有统计学差异（F=85.01,P＜0.05）。同Con组（0.394±0.006）相比,NC组（0.425±0.012）吸光度无明显变化（P＞0.05）,IDO组（0.254±0.001）吸光度显著降低（P＜0.05）;同IDO组（0.254±0.001）相比,1-MT组（0.480±0.016）吸光度明显增高（P＜0.05）。2、流式细胞仪检测共培养体系中CD4+T细胞凋亡情况发现,四组比较有统计学差异（F=19.42,P＜0.05）。同Con组（20.27±2.626%）相比,NC组（18.7±1.629%）CD4+T细胞凋亡无明显变化（P＞0.05）,IDO组（38.37±0.338%）细胞凋亡显著增多（P＜0.05）;同IDO组（38.37±0.338%）相比,1-MT组（28.83±0.275%）细胞凋亡明显降低（P＜0.05）。3、流式细胞仪检测共培养体系中CD4+CD25+Foxp3+的Tregs比例发现,四组比较有统计学差异（F=11.13,P＜0.05）。同Con组（4.647±0.737%）相比,NC组（5.11±1.01%）无明显变化（P＞0.05）,IDO组（12.42±0.61%）Tregs比例明显增多（P＜0.05）;同IDO组（12.42±0.61%）相比,1-MT组（5.783±1.175%）Tregs比例明显降低（P＜0.05）。4、ELISA检测TGF-β、IFN-γ、IL-10发现,四组比较有统计学差异（F=27.79,P＜0.05）（F=35.34,P＜0.05）（F=9.956,P＜0.05）。同Con组（31.12±0.359 Pg/m L,32.26±5.797 Pg/m L,19.27±3.346 Pg/m L）相比,NC组（33.10±0.216 Pg/m L,32.26±3.759 Pg/m L,19.11±3.855 Pg/m L）浓度无明显变化（P＞0.05）,IDO组（37.69±0.856 Pg/m L,64.52±4.757 Pg/m L,45.46±2.350 Pg/m L）浓度明显增高（P＜0.05）;同IDO组（37.69±0.856 Pg/m L,64.52±4.757 Pg/m L,45.46±2.350 Pg/m L）相比,1-MT组（32.87±0.475 Pg/m L,36.07±4.389 Pg/m L,13.71±0.599 Pg/m L）浓度明显降低（P＜0.05）。经ELISA检测IL-2发现,四组比较有统计学差异（F=33.38,P＜0.05）。同Con组（167.7±12.71 Pg/m L）相比,NC组（134.7±6.009 Pg/m L）浓度无明显差异（P＞0.05）,IDO组（64.11±12.56 Pg/m L）浓度明显降低（P＜0.05）;同IDO组（64.11±12.56 Pg/m L）相比,1-MT组（143.0±14.37 Pg/m L）浓度明显升高（P＜0.05）。二、低免疫原性表皮干细胞移植修复创面的实验研究1、各组小鼠术后创面面积逐渐缩小,术后第7天,四组创面愈合率比较有统计学差异（F=42.34,P＜0.05）。与NC组（0.676±0.0268）、1-MT组（0.687±0.0197）、PBS组（0.682±0.232）相比,移植低免疫原性表皮干细胞的创面（0.727±0.0336）愈合率增加（P＜0.05）。2、术后第5天、7天,免疫荧光染色检测创面GFP发现,四组比较有统计学差异（F=129.5,P＜0.001）（F=90.83,P＜0.001）。与NC（27.24±3.842）（20.46±4.271）、1-MT（23.24±3.842）（25.96±5.157）和PBS组（0±0）（0±0）相比,IDO组创面（32.52±3.475）（40.80±4.236）过表达GFP,表明IDO组移植细胞存活率明显增高。3、术后第5天,免疫荧光共染检测创面IDO和CD4发现,四组比较有统计学差异（F=96.97,P＜0.001）（F=88.54,P＜0.001）。同NC组（0.0418±0.033%）创面组织的IDO和CD4阳性细胞数比例相比,PBS组（0.1176±0.2084%）IDO阳性细胞数比例无明显变化（P＞0.05）,IDO组（5.573±0.686%）创面组织IDO阳性细胞数比例显著增多（P＜0.001）;同IDO组（5.573±0.686%）相比,1-MT组（2.531±0.942%）IDO阳性细胞数比例显著减少（P＜0.001）。同NC组（10.08±1.109%）创面组织的CD4阳性细胞数比例相比,PBS组（8.819±0.928%）CD4阳性细胞数比例无明显变化（P＞0.05）,IDO组（1.498±0.097%）创面组织CD4阳性细胞数比例显著减少（P＜0.001）;同IDO组（1.498±0.097%）相比,1-MT组（4.712±1.175%）CD4阳性细胞数比例显著增加（P＜0.001）。术后第7天,免疫荧光共染检测创面IDO和CD4发现,四组比较有统计学差异（F=85.06,P＜0.001）（F=131.3,P＜0.001）。同NC组（0.0418±0.03%）（0.4038±0.073%）创面组织的IDO阳性细胞数比例相比,PBS组（0.118±0.2%）IDO阳性细胞数比例无明显变化（P＞0.05）,IDO组（5.573±0.686%）（5.053±0.641%）创面组织IDO阳性细胞数比例显著增多（P＜0.001）;同IDO组（5.573±0.686%）（5.053±0.641%）相比,1-MT组（2.531±0.942%）（2.310±0.862%）IDO阳性细胞数比例显著降低（P＜0.01）。同NC组（9.281±0.543%）创面组织的CD4阳性细胞数比例相比,PBS组（8.219±0.910%）CD4阳性细胞数比例无明显变化（P＞0.05）,IDO组（1.818±0.420%）创面组织CD4阳性细胞数比例显著减少（P＜0.001）;同IDO组（1.818±0.420%）相比,1-MT组（4.15±0.747%）CD4阳性细胞数比例显著增加（P＜0.01）。术后第5天,免疫荧光共染检测创面IDO和Fox P3发现,四组比较有统计学差异（F=186.7,P＜0.001）（F=124.8,P＜0.001）。同NC组（0.033±0.0246%）（0.13±0.018%）创面组织的IDO和Fox P3阳性细胞数比例相比,PBS组（0.182±0.096%）（0.022±0.004%）IDO和Fox P3阳性细胞数比例无明显变化,IDO组（4.967±0.717%）（1.702±0.336%）创面组织IDO和Fox P3阳性细胞数比例显著增加（P＜0.001）;同IDO组（4.967±0.717%）（1.702±0.336%）相比,1-MT组（2.188±0.595%）（0.0366±0.007%）IDO和Fox P3阳性细胞数比例显著减少（P＜0.001）。术后第7天,免疫荧光共染检测创面IDO和Fox P3发现,四组比较有统计学差异（F=186.7,P＜0.001）（F=124.8,P＜0.001）。同NC组（0.0454±0.044%）（0.182±0.056%）创面组织的IDO和Fox P3阳性细胞数比例相比,PBS组（0.0298±0.007%）（0.096±0.050%）IDO和Fox P3阳性细胞数比例无明显变化,IDO组（4.882±0.543%）（1.562±0.325%）创面组织IDO和Fox P3阳性细胞数比例显著增加（P＜0.001）;同IDO组（4.882±0.543%）（1.562±0.325%）相比,1-MT组（2.197±0.519%）（0.097±0.058%）IDO和Fox P3阳性细胞数比例显著减少（P＜0.001）。4、术后第5、7天,IDO酶活性试剂盒检测创面IDO酶活性结果显示,四组比较有统计学差异（F=17.47,P＜0.01）（F=18.89,P＜0.01）。同NC组（0.5189±0.1628 U/g）（0.5095±0.149 U/g）相比,PBS组（0.6761±0.2659 U/g）（0.6936±0.2747 U/g）酶活性无明显变化（P＞0.05）,IDO组（1.398±0.1525U/g）（1.435±0.1669 U/g）酶活性明显增高（P＜0.01）;同IDO组（1.398±0.1525 U/g）（1.435±0.1669 U/g）相比,1-MT组（0.722±0.2308 U/g）（0.7034±0.2279 U/g）酶活性明显降低（P＜0.01）。结论1、低免疫原性表皮干细胞的构建（1）通过转染IDO基因,表皮干细胞稳定高效的过表达IDO蛋白。（2）过表达IDO蛋白后,表皮干细胞的表型未发生改变。（3）表皮干细胞过表达IDO后,IDO酶活性提升,可抑制异体CD4+T细胞增殖,促进异体CD4+T细胞凋亡,促进CD4+T细胞向Tregs转化,这表明过表达IDO的表皮干细胞具有低免疫原性。（4）过表达IDO促进Tregs的生成可能同其促进TGF-β、IFN-γ、IL-10表达,抑制IL-2表达相关。2、低免疫原性表皮干细胞移植修复创面的实验研究过表达IDO可以显著提高表皮干细胞移植修复异体小鼠创面的愈合效果,并对自身有免疫保护作用,可为临床开发低免疫原性皮肤替代物提供新思路。