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背景基因治疗是维持骨缺损局部生长因子有效治疗浓度进而提高疗效最有希望的一种方法,但是基因工程在骨缺损的治疗中存在种子细胞来源受限制、单一目的基因缺乏协同性等问题。BMP-2(Bone morphogentic protein-2,骨形态发生蛋白)和bFGF (Basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子)基因分别修饰的种子细胞均能够有效地在骨组织工程中发挥作用,且ADSCs(Adipose Derived Stem Cells,脂肪源性基质细胞,脂肪干细胞)作为种子细胞具有来源广泛、含量丰富等优点,有重要的研究价值。生长因子的有效浓度对于脂肪存活亦有很大关系。自体颗粒脂肪是一种良好的组织充填材料,取材方便,无组织排异性,但在进行游离移植时存在吸收率高、存活率低等问题。VEGF(Vascular endothelial growth factor,血管内皮细胞生长因子)具有良好的促进血管形成能力,壳聚糖微囊作为缓释载体可以稳定的释放携带的生长因子并且没有毒性,易于降解。目的1)研究壳聚糖纳米微囊介导双基因(BMP-2/bFGF)复合体转染于ADSCs之后的成骨性能。2)研究多种基因载体介导携带荧光基因的质粒转染于ADSCs后的转染率,筛选出能高效表达目的基因的基因载体。3)研究慢病毒介导双基因(BMP-2/bFGF)复合体转染于ADSCs之后的成骨性能。4)观察VEGF与壳聚糖微囊复合的缓释系统对自体脂肪移植成活率的影响。方法1)采用壳聚糖纳米微囊介导双基因(BMP-2/bFGF)复合体转染于ADSCs,设置空白组(壳聚糖)、BMP-2对照组(壳聚糖+BMP-2)、bFGF对照组(壳聚糖+bFGF)、实验组(壳聚糖+bFGF+BMP-2),对转染率、目的基因的表达、成骨性能指标OCN(骨钙素)和BSP(骨唾液蛋白)进行检测,并应用于裸鼠进行股后肌群注射成骨和股骨缺损的修复实验研究。2)采用壳聚糖、季铵化壳聚糖、季铵化壳寡糖、X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent.脂质体、慢病毒分别转染携带荧光基因的质粒于ADSCs,荧光显微镜下观察转染率。3)采用慢病毒介导双基因(BMP-2/bFGF)复合体转染于ADSCs,设置空病毒组(慢病毒)、BMP-2对照组(BMP-2-慢病毒)、bFGF对照组(bFGF-’慢病毒)、实验组(bFGF-BMP-2-慢病毒),对转染率、目的基因的表达、成骨性能指标OCN(骨钙素)和BSP(骨唾液蛋白)进行检测,观察对细胞凋亡和增殖的影响,并应用于裸鼠进行皮下注射成骨和颅骨缺损的修复实验研究。4)从人体获取脂肪,经纯化,消化后按加入物不同分成4组,即实验组(脂肪+VEGF壳聚糖微囊)、壳聚糖微囊对照组(脂肪+空壳聚糖微囊)、VEGF组(脂肪+VEGF)、空白组(脂肪)。各混和组中脂肪组织与壳聚糖、生长因子或生长因子复合缓释载体的比例均为3：1。各组混合物分别注射于裸鼠背部皮下。分别在术后3,6,12周取材,行移植物质量、电镜超微结构、组织学染色和微血管CD34染色检测。结果1)壳聚糖纳米微囊介导的双基因(BMP-2/bFGF)复合体转染ADSCs的效率较低,为5%-10%。实验组的目的基因协同表达能力均优于对照组和空白组,在成骨指标OCN和BSP的表达上均明显优于对照组和空白组,且具有统计学差异(p<0.01)。在股后肌群异位成骨和股骨缺损的修复获得阴性结果。2)壳聚糖的转染率为5%-10%,季铵化壳聚糖为1%-5%,季铵化壳寡糖为5%-10%, X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent为15%-20%,脂质体为5%-10%,慢病毒为90%-95%。慢病毒的转染效率为最高。3)慢病毒转染效率高达90%-95%,介导的实验组的目的基因协同表达能力优于对照组和空病毒组,在成骨指标OCN和BSP的表达上均明显优于对照组和空病毒组,且具有统计学差异(p<0.01),实验组和对照组与空病毒组相比,对细胞凋亡是有抑制作用的,并且促进细胞的增殖。在皮下异位成骨和颅骨缺损的修复获得阴性结果。4)实验组(壳聚糖微囊复合VEGF)的移植物重量和血管密度均高于对照组,具有统计学意义,其余各对照组间差别无统计学意义。结论1)壳聚糖纳米微囊介导的双基因(BMP-2/bFGF)转染ADSCs具有良好的目的基因协同表达能力和成骨性能。2)慢病毒载体介导的ADSCs转染有最高的转染效率,且在多次传代后稳定表达。3)慢病毒介导的双基因(BMP-2/bFGF)共转染ADSCs具有良好的BMP-2和bFGF协同表达能力,有较高的转染率并能促进成骨。4)壳聚糖微囊作为载体构建的VEGF复合物能促进移植后脂肪组织血管的生成从而提高脂肪游离移植的成活率。