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新疆雪莲(Saussurea involucrate Kar.et.Kir.)是我国名贵中药材,其主要药用活性成分为类黄酮化合物。民间用于治疗风湿性关节炎、月经不调、妇科疾病等。目前人们对新疆雪莲及它的类黄酮化合物的需求日益增多,但雪莲的人工栽培技术尚未成熟,在野生状态下,新疆雪莲生长在海拔3,000到4,000米的雪山上,现在由于过度采挖已濒临灭绝。为解决雪莲资源匮乏,提高雪莲中类黄酮成分的含量,本研究在对从水母雪莲cDNA文库中克隆到的类黄酮代谢途径中的限速酶-二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)进行初步功能鉴定的基础上,将其应用在类黄酮次生代谢的调控上,通过基因工程手段利用根癌农杆菌EHA105将其导入新疆雪莲胚性愈伤,产生新疆雪莲转基因组培苗,以期提高新疆雪莲的类黄酮物质含量,进行新疆雪莲类黄酮物质的生产。主要结果如下:
1.对克隆到的水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因SmDFR进行原核表达。将SmDFR基因与pGEX-4T-1载体连接,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,经PCR和酶切鉴定,构建成功。将携带有SmDFR-pGEX-4T-1的大肠杆菌BL21(DE3)经过IPTG诱导,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示,表达出了64.6KD的蛋白,与预期的蛋白大小一致,说明原核表达成功。对该蛋白做可溶性检测,结果显示,水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因SmDFR表达的蛋白主要以不可溶的形式存在于包涵体中。
2.将水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因SmDFR正义方向连接入pBI121质粒中,液氮冻融法导入根癌农杆菌LBA4404,转化烟草W38。PCR结果显示SmDFR基因已经整合到烟草W38中。对转基因烟草的总黄酮含量和花色素含量进行分析,结果显示,转基因烟草叶片的总黄酮含量两个株系下降,而转基因烟草花瓣的花色比对照加深,花色素含量比对照提高,最高可提高68％,说明水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因SmDFR得到了有效表达,是有活性的,与花色素和总黄酮的合成具有明显的相关性。
3.将水母雪莲二氢黄酮醇-4-还原酶基因SmDFR反义方向连接入pCAMBIA-1302质粒中,液氮冻融法导入根癌农杆菌EHA105中,转化新疆雪莲胚性愈伤。对获得的转基因新疆雪莲PCR检测显示SmDFR已经整合到新疆雪莲基因组中。对转基因新疆雪莲苗进行黄酮含量的测定,结果显示,部分株系的总黄酮含量比对照有了显著的提高,最高提高了41％。本研究为通过基因工程手段提高新疆雪莲类黄酮物质提供了一个有效的方法,并将一般用来改变花色的DFR基因用于次生代谢的调控上。