论文部分内容阅读
世界各国的专家和学者都在努力寻找一种快速检测大肠杆菌的新方法,目前已经发展了分子生物学检测方法、酶底物法及免疫学方法等。本文从医药废水中筛选出大肠杆菌,制备免疫原,采用多克隆抗体制备技术制备了抗大肠杆菌抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附法,并在此基础上研制了间接ELISA试剂盒,具体成果如下:1.从医药废水中筛选大肠杆菌,制备大肠杆菌全菌体免疫原,然后,使用该免疫原对新西兰大白兔免疫,获得兔抗大肠杆菌免疫血清,经过辛酸-硫酸铵两步法纯化后获得抗血清,其效价为12800,经过计算纯化后抗体的蛋白质的含量为2.50mg/mL。2.建立了大肠杆菌的间接ELISA快速检测方法,优化确定了具体实验参数:包被抗原的最佳使用稀释度为200倍,酶标二抗和一抗的最佳稀释度分别为2000倍和12800倍;0.5%BSA为最佳封闭液,封闭2h作为最佳封闭时间;选择37℃温育60min,含4%PEG稀释液作为最佳的抗原与一抗的反应条件;选择37℃温育60min,含4%PEG稀释液作为最佳的一抗与二抗的温育条件。3.进行了大肠杆菌的梯度实验,浓度在1012cfu/mL-10cfu/mL之间,用所建立的间接竞争ELISA法测定,结果表明在103cfu/mL-109 cfu/mL有良好的线性关系,表明ELISA的检测限为103cfu/mL。将预处理后的医药废水梯度稀释,用所建立的间接竞争ELISA法测定,同时与国标法(MPN法)和活菌计数法做比较,结果表明间接ELISA测得结果与MPN所测结果一致,但是由于间接ELISA对死菌能检出,所以检测值较MPN法大。4.制备了间接ELISA试剂盒,对所组建试剂盒进行了包被时间的优化,试验结果表明该试剂盒在37℃下包被1h,与在4℃下包被过夜所测的OD值相近,所以本试剂盒选择在37℃下包被1h作为包被时间;对自制的试剂盒进行了方法学评价,包括:特异性、重复性及灵敏度。对分别含有大肠杆菌(所筛选)、E.coli、酵母菌、雷氏普罗威登斯菌(Providencia Rettgeri)、粪产碱杆菌(Alcaligenes Faecalis)的样品进行检测,结果表明非大肠杆菌对检测结果没有影响,说明该法具有较强的特异性;用五种不同样品对板间和板内分别做了重复性实验,仅有很少几分样品变异系数超过10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;对大肠杆菌的最低检出限为103cfu/mL。