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研究目的:构建LRG47/Rv2031c共表达重组慢病毒载体疫苗,使其能在巨噬细胞(MΦ)中特异性表达自噬诱导蛋白LRG47和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis Mtb)持留状态下特异表达的免疫优势抗原Rv2031c。然后从分子、细胞水平探讨其杀伤Mtb的效果及相关机制。研究方法:1.采用PCR的方法扩增出Rv2031c编码基因和2031-LRG47基因片段,分别克隆入含巨噬细胞特异性启动子的慢病毒表达质粒pLenti-146-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47,构建成功后采用限制性内切酶酶切和测序法进行鉴定。2.分别将重组慢病毒表达质粒pLenti,pLenti-146-GFP,pLenti-2031和pLenti-2031-LRG47与慢病毒包装质粒pMD2G,pSPAX2以一定比例共转染293T细胞,72h后收集相应的病毒颗粒,并用超滤离心管浓缩法浓缩所收集的病毒颗粒,获得重组慢病毒LV-Lenti,LV-Lenti-146-GFP,LV-Lenti-2031,LV-Lenti-2031-LRG47。然后通过流式细胞仪的方法检测LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7细胞后GFP阳性细胞的比例来获取所包装慢病毒的滴度,以确定后续研究中慢病毒感染的最适滴度。3.将重组慢病毒LV-Lenti-146-GFP感染RAW264.7细胞,分别于感染后的24h,48h,72h,96h在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况,以选择重组慢病毒感染RAW264.7细胞的最佳时间点,用于后续研究。并在选择的最佳时间点通过荧光定量PCR和Western-blot的方法检测巨噬细胞内Rv2031c和LRG47的表达情况。4.采用上述重组慢病毒感染RAW264.7细胞,72h后以MOI=5:1的比例分别感染H37RV和H37RV-GFP,感染4h后洗去未被巨噬细胞吞噬的菌并以此为0h,采用流式细胞法检测0h时巨噬细胞吞噬H37Rv-GFP的水平,然后分别在H37RV感染后的不同时间点用0.1%SDS裂解细胞,稀释后涂于7H10固体平板,待菌落生长后计数,以检测重组慢病毒对巨噬细胞杀伤Mtb能力的影响。5.采用上述重组慢病毒感染RAW264.7细胞,72h后进行以下指标的检测,以探讨其对巨噬细胞影响的可能机制:(1)通过western-blot的方法检测细胞自噬相关蛋白lc3的表达情况,采用cyto-idautophagydetectionkit试剂盒检测各组细胞的自噬水平。(2)通过免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下观察mtb与溶酶体的共定位情况。(3)采用流式细胞法检测巨噬细胞表面mhcii,cd80的表达水平。6.采用ova致敏balb/c小鼠,用于制备ova致敏淋巴细胞。采用上述重组慢病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,48小时后加入ova进行抗原荷载,72小时后加入ova致敏的小鼠脾淋巴细胞进行混合培养,然后分别于混合培养后不同时间检测淋巴细胞的增殖和活化水平,以探讨重组慢病毒对巨噬细胞抗原提呈能力的影响。研究结果:1.酶切和测序结果显示,重组慢病毒表达质粒plenti-2031和plenti-2031-lrg47构建成功。2.重组慢病毒lv-lenti,lv-lenti-146-gfp,lv-lenti-2031,lv-lenti-2031-lrg47包装成功,且通过检测滴度在1-2×107tu/ml以上,可用于后续的研究。重组慢病毒gfp表达时相的观察结果显示重组慢病毒感染raw264.7细胞的最佳时间点为72h。3.荧光定量pcr和western-blot的检测结果证实重组慢病毒携带的重组基因rv2031c和lrg47均可在raw264.7细胞中有效表达。4.流式细胞术检测荷菌量检测结果表明,重组慢病毒感染不会显著影响巨噬细胞对结核分枝杆菌的吞噬能力,但与对照组相比,lv-lenti-2031-lrg47可显著增强巨噬细胞对mtb的杀伤功能。5.与对照组相比,lv-lenti-2031-lrg47可以显著提高巨噬细胞的自噬水平,促进巨噬细胞内mtb与溶酶体的融合。6.与对照组相比,lv-lenti-2031-lrg47可以显著提高巨噬细胞表面mhcⅡ和cd80的表达水平。同时,混合细胞培养结果显示,lv-lenti-2031-lrg47感染可显著增强巨噬细胞活化淋巴细胞的能力。结论:1.本研究成功构建了lrg47/rv2031c重组慢病毒表达质粒,完成了慢病毒的包装与浓缩,实现了其在巨噬细胞中的有效表达。2.本研究证实lrg47/rv2031c重组慢病毒可以增强巨噬细胞对胞内mtb的杀伤能力。3.本研究证实LRG47/Rv2031c重组慢病毒可诱导巨噬细胞发生自噬,并提高巨噬细胞内含Mtb的吞噬体与溶酶体的融合。4.本研究证实LRG47/Rv2031c重组慢病毒可有效提高巨噬细胞的抗原提呈功能。