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研究目的:环境重金属污染对人类健康的影响已成为一种全球性公共卫生问题,其中危害严重的主要包括铅（Lead,Pb）,镉（Cadmium,Cd）和汞（Mercury,Hg）。它们通常共存于人类生活环境中,通过多种途径进入人体,并在一般人群的血液中能够同时检测到这三种重金属。课题组前期研究发现一般人群血液负荷及其相关水平的低剂量重金属Pb、Cd和Hg混合暴露可引起大鼠学习记忆损伤和突触结构可塑性损伤,然而机制尚不清楚。树突出枝相关蛋白Arp2/3复合物和剪切相关蛋白Cofilin在神经元树突分支形态形成过程中均起到重要作用。最新研究发现,Cofilin可以加快Arp2/3从肌动蛋白丝上解离的速度,并促进肌动蛋白丝分支的解离,引起肌动蛋白平衡紊乱进而导致树突形态结构损伤。因此,本研究通过建立低剂量重金属混合染毒的原代海马神经元模型,调控Cofilin-Arp2/3通路的表达,探究低剂量铅、镉、汞混合暴露对海马神经元树突形态影响及其机制,以期为防治重金属复合污染所致神经损伤的提供新靶点。实验方法:（1）建立一般人群血液负荷水平的低剂量重金属Pb、Cd、Hg混合暴露原代海马神经元模型。通过鬼笔环肽对F-actin进行染色检测低剂量重金属混合暴露对海马神经元树突形态复杂性的影响;Western Blot检测树突骨架肌动蛋白F-actin/G-actin平衡,并检测树突分支形成的关键蛋白Arp2和Arp3亚基的表达情况;免疫荧光共染Arp3和肌动蛋白丝的结合能力。并通过慢病毒HBLV-Arp3感染高表达神经元Arp3表达水平,观察低剂量重金属混合暴露对Arp3和F-actin的结合能力、肌动蛋白平衡以及树突复杂程度的影响。（2）原代海马神经元浓度梯度低剂量重金属混合暴露后,检测剪切相关蛋白Cofilin的表达水平,Cofilin和F-actin的结合能力;并通过干扰片段si RNA-Cofilin敲低海马神经元中Cofilin表达,观察海马神经元Cofilin和肌动蛋白丝结合、肌动蛋白平衡以及树突复杂程度的影响。（3）原代海马神经元浓度梯度低剂量重金属混合暴露后,免疫荧光共染检测Cofilin和Arp3在海马神经元中的共表达程度。通过si RNA-Cofilin敲低海马神经元中Cofilin表达水平后,观察低剂量重金属所致Arp3表达及其与肌动蛋白丝结合能力损伤的影响。同时,慢病毒HBLV-Arp3高表达神经元Arp3表达水平后,观察低剂量重金属所致Cofilin表达异常的影响。（4）在体外反应体系,通过大肠杆菌表达系统纯化丝切蛋白Cofilin,应用EMR质谱技术在体外分析重金属离子及其混合暴露与Cofilin蛋白组分子之间的结合作用。通过多功能酶标仪检测肌动蛋白聚合和解聚过程中的荧光变化反应肌动蛋白动力学,在此基础上在反应体系中加入Cofilin和重金属,探讨Cofilin对肌动蛋白的剪切作用及低剂量重金属混合暴露的影响。结果:（1）树突出枝相关蛋白Arp2/3在低剂量重金属混合暴露对神经元树突形态异常中的作用。低剂量重金属铅、镉、汞混合暴露引起树突复杂程度浓度依赖性下降,表现为平均树突长度和分支末端数目下降（P＜0.05）。并伴随着骨架肌动蛋白的平衡紊乱,其中丝状肌动蛋白F-actin的表达量下降而单体肌动蛋白G-actin的表达量上升,F-actin/G-actin的比值下降（P＜0.05）。树突分支形成的关键蛋白Arp3的表达水平及其与肌动蛋白丝的结合能力随着低剂量重金属暴露剂量增加出现浓度依赖性下降（P＜0.05）。慢病毒HBLV-Arp3感染有效提高了神经元Arp3表达水平。进一步检测发现HBLV-Arp3感染也改善了低剂量重金属混合暴露引起的Arp3和F-actin的结合能力、肌动蛋白平衡以及树突复杂程度的损伤（P＜0.05）。（2）树突剪切相关蛋白Cofilin在低剂量重金属混合暴露致神经元树突形态异常中的作用。低剂量重金属铅、镉、汞混合暴露引起树突剪切相关蛋白Cofilin的表达水平浓度依赖性上升,且伴随着Cofilin和肌动蛋白丝的结合能力增加,剪切能力增强（P＜0.05）。小干扰片段si RNA-Cofilin转染有效敲低了神经元Cofilin表达水平。进一步检测发现si RNA-Cofilin转染也改善了低剂量重金属混合暴露引起的Cofilin和F-actin的结合能力、肌动蛋白平衡以及树突复杂程度的损伤（P＜0.05）。（3）Cofilin调控Arp2/3在低剂量重金属混合暴露致神经元树突骨架肌动蛋白平衡异常中的作用。低剂量重金属铅、镉、汞混合暴露引起海马神经元Cofilin和Arp3共表达浓度依赖性上升（P＜0.01）。si RNA-Cofilin敲低海马神经元中Cofilin表达水平改善了低剂量重金属混合暴露所致Arp3表达及其与肌动蛋白丝结合能力损伤（P＜0.05）。然而,HBLV-Arp3高表达Arp3后对低剂量重金属混合暴露所致Cofilin表达异常并没有影响（P＞0.05）。揭示Cofilin作为上游分子调控Arp3在低剂量重金属混合暴露致神经元树突形态异常中起重要分子机制作用。（4）低剂量重金属离子与Cofilin蛋白分子的直接结合作用及其对Cofilin抑制肌动蛋白聚合功能的影响。质谱技术检测发现低剂量重金属Hg离子在体外能够和Cofilin结合,且Pb离子和Cd离子能促进Cofilin蛋白分子与Hg离子结合。此外,通过肌动蛋白聚合-解聚体系发现,体外低剂量重金属混合暴露并不会直接影响Cofilin抑制肌动蛋白聚合功能。结论:低剂量重金属Pb、Cd和Hg混合暴露所致海马神经元树突形态异常可能是通过Cofilin调控的Arp2/3引起的。且低剂量重金属离子及其混合暴露能与Cofilin蛋白分子直接结合。提示这可能成为防治低剂量重金属混合暴露引起神经元树突形态异常所致神经损伤的新靶点。