【摘 要】
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该课题首先采用HPV16 E7特异性引物,利用PCR扩增对湖北地区不同时期(2001年、2000年、1996年和1994年)宫颈癌组织样品进行HPV16 E7基因的分离,用pGEM-T载体对分离的HPV16 E7
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该课题首先采用HPV16 E7特异性引物,利用PCR扩增对湖北地区不同时期(2001年、2000年、1996年和1994年)宫颈癌组织样品进行HPV16 E7基因的分离,用pGEM-T载体对分离的HPV16 E7基因进行克隆和序列分析,利用生物信息学的方法对不同时期HPV16 E7基因进行了比较,分析其变异情况及病毒感染变异趋势.根据上述实验,我们确定了HPV16E7抗原基因序列,为第二步研制人乳头瘤病毒DNA疫苗奠定基础.该实验自行设计突变引物,利用PCR定点法突变了E7基因C末端的锌指结构区,并将热休克蛋白70(HSP70)基因嵌合克隆到真核表达载体pcDNA3.1<->质粒的EcoRI与HindⅢ酶切位点之间,构建出嵌合型pcd-HPV<,16>E7-HSP<,70>DNA疫苗.然后经DNA测序,确认了E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架的正确性,继而采用脂质体法将pcd-HPV<,16>E7-HSP<,70>转染人A549细胞,经G418筛选出阳性克隆后,提取其RNA,RT-PCR检测E7基因表达水平.综上所述:我们采取突变E7蛋白C末端锌指结构及融合HSP70基因的策略,在国内、外首次成功构建了pcd-HPV<,16>E7m-HSP<,70>嵌合疫苗,该疫苗能够诱导免疫小鼠产生特异性体液及细胞免疫反应,较野毒疫苗有更强的抗原性及免疫原性.
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