【摘 要】
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背景:由于原发性肝癌起病隐匿,早期症状不明显,因此难以发现,多数患者确诊时已为中晚期。目前手术切除术是肝癌治疗的首选方案,但因术后易转移复发和肿瘤的耐药性,使原发性肝癌的治疗结果仍不理想。中药被广泛应用于癌症的预防和治疗,是中晚期肝癌的主要治疗措施之一。姜黄素是从姜科类植物中提取出的一种天然活性成分,毒副作用小,在肝癌治疗研究中表现出良好的开发潜力和应用前景,但姜黄素对肝癌侵袭转移的抗肿瘤机制尚不
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背景:由于原发性肝癌起病隐匿,早期症状不明显,因此难以发现,多数患者确诊时已为中晚期。目前手术切除术是肝癌治疗的首选方案,但因术后易转移复发和肿瘤的耐药性,使原发性肝癌的治疗结果仍不理想。中药被广泛应用于癌症的预防和治疗,是中晚期肝癌的主要治疗措施之一。姜黄素是从姜科类植物中提取出的一种天然活性成分,毒副作用小,在肝癌治疗研究中表现出良好的开发潜力和应用前景,但姜黄素对肝癌侵袭转移的抗肿瘤机制尚不完全明确。Bcl-2相关转录因子1（BCL-2 associated transcription factor 1,Bclaf1）最初被认定为是与促细胞凋亡和转录相关的调节因子,其异常表达与肝癌发生密切相关。Wnt/β-catenin信号通路高度保守,通路蛋白级联反应异常促进癌症干细胞更新、细胞增殖和分化,导致不同肝脏疾病以及肝癌的发生发展。本研究拟探讨姜黄素通过Bclaf1调控Wnt/β-catenin通路抑制人肝癌细胞侵袭转移的作用机制。目的:通过体内实验和体外实验,探讨姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1侵袭转移的作用以及Bclaf1的调控分子机制。方法:采用CCK8法,检测姜黄素（0、10、20、40、60μM）和5FU（10μM）对人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1的增殖影响;采用划痕愈合实验,检测经姜黄素处理后人肝癌细胞的体外迁移能力;采用Transwell小室法,检测姜黄素处理后人肝癌细胞的体外侵袭能力;利用蛋白质印迹法,检测肝癌细胞中Bclaf1、侵袭转移及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达,加入通路抑制剂PKF-118-310,进一步检测Wnt/β-catenin通路蛋白在姜黄素抑制人肝癌细胞侵袭转移中的作用;应用CRISPR/Cas9技术敲除Bclaf1基因以进一步明确姜黄素抑制人肝癌细胞侵袭转移机制中Bclaf1的调控作用;建立人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型,并通过尾静脉注射HepG2细胞模拟肿瘤细胞肺转移,分为阴性对照组、阳性对照组（5FU）、姜黄素药物实验组（20、40、60μM）;测量皮下肿瘤体积大小,检测姜黄素对裸鼠移植瘤的抑制作用;利用HE染色法和计算肺结节数,观察姜黄素对肿瘤细胞肺转移的影响;利用western blot技术,检测β-catenin、p-β-catenin、TCF4、c-Myc的表达;利用免疫组织化学法,检测Bclaf1、MMP2以及MMP9的表达。结果:姜黄素作用人肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1后,细胞增殖受到抑制,并存在时间剂量依赖性;随姜黄素浓度升高,人肝癌细胞的体外迁移能力逐渐减弱,穿过小室的侵袭细胞数量减少;Western blot结果显示姜黄素不同浓度组细胞中的侵袭转移相关蛋白MMP2、MMP9的表达下调,还发现姜黄素可以抑制人肝癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达,加入通路抑制剂PKF-118-310后,姜黄素对β-catenin、p-β-catenin、TCF4、c-Myc表达的抑制作用进一步增强;同时,姜黄素抑制人肝癌细胞中Bclaf1的表达。与对照组比较,姜黄素再作用稳定敲除Bclaf1后的人肝癌细胞,体外迁移和侵袭能力均进一步减弱,而且Wnt/β-catenin相关蛋白表达明显下调,MMP2、MMP9的表达进一步下降。姜黄素抑制裸鼠移植瘤的生长。姜黄素作用组小鼠肺结节数量减少,明显改善肿瘤细胞肺转移。肿瘤组织中Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达减少,Bclaf1、MMP2、MMP9的表达量下调。结论:姜黄素抑制人肝癌细胞侵袭转移,可能是通过抑制Bclaf1的表达,调控Wnt/β-catenin通路实现的。
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