细叶石斛多糖的分离纯化、 化学修饰及生物活性的研究

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石斛属中多种植物的茎可作药用,统称石斛,具有调节免疫力,保肝护肝等功效,用于多种疾病的防治,细叶石斛是药用石斛的一种,具有强身健体的作用。国内外有关研究显示,多糖是药用石斛中的主要有效成分。多糖的生物活性与其分子量、空间结构以及取代基种类、含量等密切相关。多糖分子量较大和一些特殊基团的存在,会导致其生物活性较低。本文在研究细叶石解多糖结构的基础上,对其进行降解、脱乙酰基和羧甲基化等化学修饰,并比较他们的体外抗氧化活性和抑菌活性,以期得到生物活性更好的多糖衍生物。主要的研究结果如下:1.采用水提醇沉法从细叶石斛中提取多糖,Sevag法对其进行脱蛋白,得到细叶石斛粗多糖(PDH),通过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱和Sephadex G-200层析柱进行纯化分级,得到三个精制多糖(PDH-W-1,PDH-W-2,PDH-S-1),通过高效液相凝胶色谱法测定分子量,分别为 4.04×104Da,8.35×103Da,8.78×106Da,经气相色谱,红外光谱,核磁共振分析得出:三种精制多糖均主要由部分乙酰化的甘露糖通过β-(1→4)糖苷键连接而成,含有少量葡萄糖,区别主要在于糖链的长度。2.采用H2O2-Vc联合法对PDH进行降解,得到降解多糖(DGPDH)。通过响应曲面法对降解条件进行优化,得出最佳降解条件为H2O2-Vc 20 mM/L,反应时间1.6 h,反应温度45.7℃,在此条件下得到的DGPDH,0.4 mg/mL时对DPPH·清除率为30.02%。3.利用热碱法对PDH的乙酰基进行脱除,得到脱乙酰基多糖(DAPDH)。通过响应曲面法优化脱乙酰化条件,得到最佳工艺条件为:NaOH 1.0 mol/L,反应时间2.5 h,反应温度73.3℃,此条件下制备的 DAPDH,0.2 mg/mL 时对 DPPH·清除率达 54.05%。4.采用碱性氯乙酸法对PDH进行羧甲基化修饰,得到羧甲基多糖(CPDH),通过IR分析,结果表明羧甲基化修饰成功。5.通过测定 PDH、PDH-W-1、PDH-W-2、PDH-S-1、CPDH、DGPDH、DAPDH清除(DPPH、ABTS)自由基的能力及铁还原能力来评价多糖的体外抗氧化活性。结果显示:与PDH相比,DAPDH与DGPDH 的抗氧化能力增强,CPDH、PDH-W-1、PDH-W-2、PDH-S-1的抗氧化能力减弱。6.通过测定多糖对受试菌(埃希氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、鸡白痢)最低抑菌浓度(MIC),衡量多糖的体外抑菌活性。结果表明:DGPDH(MIC:5、5、10、5、10 mg/mL)、DAPDH(MIC:5、2.5、5、5、5 mg/mL)、PDH-S-1(MIC:10、10、10、5、10 mg/mL)对五种菌的生长有明显抑制作用,PDH、PDH-W-1、PDH-W-2、CPDH没有明显抑菌活性。
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